结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤。2018年最新数据统计表明,在世界范围内,结直肠癌的发病率与死亡率均居恶性肿瘤的第三位,尽管近年来早期结直肠癌的诊疗手段取得很大进步,但发生远处转移的结直肠癌晚期患者的死亡率仍居高不下。因此,积极开展对结直肠癌转移机制的研究,寻找新的关键分子和治疗靶点,对于改善结直肠癌的治疗预后十分重要。肿瘤的发生发展与慢性炎症存在一定关联,肠道炎症可作为结直肠癌发生发展的重要因素。炎症小体(Inflammasome)是细胞内的一种多蛋白复合体,是炎症反应的中心环节。炎症小体由感受器蛋白(pattern recognition receptors,PRRs)、连接蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)以及效应器蛋白(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase 1)组成。当机体遭受多种内外源性信号如细菌、病毒、真菌等产生的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或机体自身损伤释放的危险相关分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMPs)的刺激时,细胞的 PRRs可识别这些信号,启动PRRs、ASC、Caspase1三者的连接,从而组装成活化的炎症小体。之后,效应蛋白Caspase1前体发生自体剪切产生成熟的四聚体形式,成熟的Caspase1剪切IL-1β前体(pro-IL-1β)和IL-18前体(pro-IL-18)产生成熟的IL-1β和IL-18并分泌到细胞外,介导炎症反应。革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是目前研究最为广泛的PAMPs,是一种经典的炎症小体激活剂。之前的研究结果多关注于免疫细胞中的炎症小体,并集中在LPS诱导免疫细胞中的炎症小体活化进而影响肿瘤的发生发展。那么,LPS能否直接诱导肿瘤细胞中炎症小体的活化进而影响细胞的运动能力呢?我们首先选取实验室现有的8株结直肠癌细胞系,在蛋白水平上检测这些细胞的炎症小体活化情况。Western Blot结果显示,SW620、DLD1、HCT8、LOVO细胞系中炎症小体活化程度较高,SW480、HT29、HCT116、RKO细胞系中炎症小体活化程度较低。之后,选取炎症小体活化程度较低的RKO细胞系,用不同浓度(0、1、2、4、8μg/ml)的炎症小体激活剂LPS处理细胞不同时间(0、4、8、12、24、48h),Western Blot 及 Caspase-Glo(?)1 Inflammasome Assay Kit 检测炎症小体活化情况。结果提示,与未处理组相比,LPS可以明显诱导RKO细胞炎症小体的活化,且在LPS浓度为1μg/ml处理24h的条件下,RKO内炎症小体活化效果最佳,因此在之后的实验中,我们均采取LPS 1μg/ml处理细胞24h的实验方案。为了进一步探索LPS诱导肿瘤细胞炎症小体活化是否影响细胞的生物学行为,我们利用细胞迁移和侵袭实验(Transwell Assay)检测LPS是否影响肿瘤细胞的运动能力。结果表明,LPS可以明显促进结直肠癌DLD1和RKO细胞系的迁移和侵袭能力;而与LPS处理组相比,当用Caspase1抑制剂Ac-YVAD-CHO 3.0μM预处理3h再用LPS处理之后,细胞迁移和侵袭能力明显下降,提示LPS通过诱导肿瘤细胞炎症小体活化以促进细胞的迁移和侵袭。NF-kB是包含多个成员的核转录因子,可参与多种生物学过程,包括细胞增殖和分化、免疫和炎症反应。NF-κB蛋白家族包含五个成员:p50(NF-κB1),p52(NF-kB2),p65(RelA),c-Rel(Rel)和 RelB,其中 p65(RelA)是目前研究最为广泛的NF-κB家族成员(下文中均记为p65NF-κB)。研究表明,在巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞中,LPS可以激活NF-κB进而诱导这些免疫细胞炎症小体活化。那么,NF-κB是否影响肿瘤细胞中炎症小体的活化呢?我们首先利用实验室已有的78例结直肠癌组织cDNA样本,分析Caspase1与p65NF-κB在RNA表达水平上的相关性,结果显示二者表达呈明显正相关(r=0.268,P=0.017)。之后,Western Blot检测发现LPS可以明显上调细胞总蛋白与核蛋白中磷酸化p65NF-κB的表达,表明LPS可以调控结直肠癌细胞中p65NF-κB的活化。为了进一步明确在LPS诱导肿瘤细胞炎症小体活化的过程中NF-κB所发挥的作用,我们采用小干扰RNA(siRNA)技术构建p65NF-κB敲降的细胞系,发现当敲降p65NF-κB之后,LPS不再发挥其活化炎症小体及促进细胞迁移和侵袭的效应。这表明,与免疫细胞中LPS诱导炎症小体活化的机制类似,在结直肠癌细胞中,LPS同样是通过调控NF-κB活化以促进细胞内炎症小体的活化;且在肿瘤细胞中,LPS通过上述机制以增强细胞的迁移和侵袭能力。研究表明,转录因子NF-κB可转录调控Snail的表达,进而促进肿瘤的进展;此外,上文结果表明,LPS可以调控p65NF-κB的活化。那么,在结直肠癌细胞中,LPS是否影响Snail的表达呢?如果是,p65NF-κB在此过程中发挥什么作用呢?我们首先分析了结直肠癌组织样本中p65NF-κB与Snail在RNA表达水平上的相关性,结果表明,Snail与p65NF-κB表达呈明显正相关(r=0.443,P<0.001)。之后,Western Blot检测发现LPS可以明显上调Snail蛋白表达量并促进其入核;而当敲降p65NF-κB之后,LPS不再发挥此效应,这表明p65NF-κB在LPS调控Snail表达过程中发挥重要作用。为了进一步探究Snail在LPS促进结直肠癌细胞迁移和侵袭过程中的作用,我们首先构建了稳定敲降Snail的结直肠癌细胞,之后分别利用LPS刺激Snail敲降及其对照细胞并检测细胞的运动能力。结果表明,在对照组中,LPS明显促进细胞的迁移和侵袭;而当敲降了 Snail之后,LPS不再发挥此作用。这说明,Snail在LPS促进细胞迁移和侵袭过程中发挥重要作用。研究表明,肿瘤细胞有异于正常细胞的代谢模式,这种代谢方式的改变称为“代谢重编程”(Metabolic Reprogramming),肿瘤转移与代谢重编程有密切联系。1930年,德国生化学家奥托·沃伯格发现,即使在氧气充足的条件下,肿瘤细胞仍显示出糖酵解水平增加以及乳酸分泌上调,这一现象称为沃伯格效应(Warburg effect)。此外,糖酵解水平上调是侵袭性癌症恶性表型的重要特征。既然LPS诱导的结直肠癌细胞内炎症小体活化可以增强细胞本身的运动能力,那么,LPS是否通过影响细胞糖酵解水平进而促进细胞的迁移和侵袭呢?我们配制了不同葡萄糖浓度(0、5、10、15mM)的细胞培养液,将细胞培养于上述糖浓度的培养液中进行细胞迁移与侵袭实验。结果表明,在无糖(葡萄糖浓度OmM)的培养条件下,LPS对结直肠癌细胞系RKO和DLD1的运动能力无影响,而在5、10、15mM葡萄糖浓度的细胞培养条件下,LPS可以明显增强细胞的运动能力。这表明,LPS促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭需要葡萄糖的存在。为了明确LPS能否直接影响细胞的糖酵解水平,我们随后利用葡萄糖和乳酸检测试剂盒检测细胞培养上清中二者浓度随时间的变化,结果发现与未处理组相比,LPS刺激可以明显促进细胞的葡萄糖消耗以及乳酸产生。上文研究结果表明Snail在LPS促进细胞迁移和侵袭过程中发挥重要作用,于是我们推测Snail在LPS调控细胞糖酵解过程中同样发挥重要作用。为了验证这一假设,我们利用稳定敲降Snail的细胞系及其对照组,分别检测LPS处理前后,各组细胞培养上清中葡萄糖及乳酸浓度。结果发现,在对照组中,LPS可以明显促进细胞的葡萄糖消耗以及乳酸产生;而当敲降Snail之后,LPS不再影响细胞糖酵解水平。这些结果表明,Snail在LPS促进细胞糖酵解过程中发挥重要作用。糖酵解过程中有三大关键限速酶,分别是己糖激酶(Hexokinase,HK)、6-磷酸果糖激酶 1(6-phosphofructokinase1,PFK-1)以及丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)。HK包括HK1、HK2、HK3及HK4四种异构体,HK4又称葡萄糖激酶,专一地作用于葡萄糖,一般仅存在肝脏中;研究表明肿瘤细胞中高表达PFK-1的PFKP异构体以及PK的PKM2异构体。因此,为了研究LPS引起细胞代谢改变的具体机制,我们检测了 LPS处理对结直肠癌细胞中HK1、HK2、HK3、PFKP、PKM2这5种糖酵解限速酶蛋白表达量的影响。结果表明,LPS不影响HK1、HK2、PFKP、PKM2这4种酶的表达量,却明显上调糖酵解第一步关键酶HK3的表达量,我们推测这可能是LPS上调结直肠癌细胞糖酵解水平的重要原因。上文提到,LPS可以上调p65NF-kB、Snail及HK3的表达,那么在LPS正向调控HK3蛋白表达的过程中,作为细胞内具有重要生物学功能的转录因子p65NF-kB与Snail,是否发挥作用呢?如果是,二者对HK3的作用是否体现在调控其基因转录上呢?结直肠癌组织样本Real-Time PCR的结果表明,在mRNA表达水平上,p65NF-kB 与 HK3(r=0.237,P=0.035)、Snail 与 HK3(r=0.327,P=0.003)均呈明显正相关。接着,我们利用Western Blot检测抑制p65NF-kB入核及敲降Snail表达之后,LPS正向调控HK3蛋白表达的作用是否受到影响。结果表明,在对照组(不加p65NF-kB入核抑制剂或未敲降Snail组)中,LPS可以上调HK3的表达;而在抑制p65NF-kB入核或敲降Snail表达之后,LPS不再发挥其上调HK3表达的作用,表明p65NF-kB及Snail均在LPS调控HK3蛋白表达过程中发挥重要作用。P65NF-kB及Snail均是细胞内重要的转录因子,可以对细胞内多种基因发挥转录调控作用。因此,我们猜测LPS是通过p65NF-kB及Snail对HK3的转录调控以影响HK3的蛋白表达。我们首先以HK3的转录起始位点为0,选取-1500至+100作为HK3 的可能启动子区,在基因转录结合位点预测网站JASPAR(http://jaspar.binf.ku.dk/)上发现,HK3启动子序列上存在多个转录因子p65NF-kB及Snail的结合位点,表明p65NF-kB及Snail有可能直接结合在HK3的启动子区调控其转录。为了进一步验证此假设,我们构建了含HK3启动子区段的荧光素酶报告基因载体,用此质粒转染细胞,利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测抑制P65NF-kB入核或敲降Snail表达之后,LPS对HK3的转录调控作用是否受到影响。结果表明,LPS可上调HK3启动子活性,而当抑制p65NF-kB入核或敲降Snail表达之后,LPS不再发挥其正向转录调控HK3的作用,表明p65NF-kB及Snail在LPS调控HK3转录过程中均发挥重要作用。值得注意的是,不加LPS时,敲降Snail本身并不影响HK3启动子活性,而p65NF-kB入核抑制剂JSH-23可明显下调HK3启动子活性,说明与Snail相比,p65NF-kB转录调控HK3的效应更明显。那么,在LPS通过p65NF-kB正向转录调控HK3启动子的过程中,p65NF-kB结合在HK3启动子区的哪个位点上呢?我们利用JASPAR预测的3个结合位点序列信息,分别构建删除(HK3-Delete-1,2,3)或突变(HK3-Mut-1,2,3)这3个位点的荧光素酶报告基因载体并转染HEK293T细胞。发现在WT组,LPS可明显上调HK3启动子活性,而在删除或突变组,LPS上调HK3启动子活性的效应消失或降低。这充分说明LPS可能通过诱导p65NF-kB直接结合在HK3启动子上以正向调控其转录。基于以上实验结果,我们推测p65NF-κB与Snail可能存在蛋白相互作用以共同调控HK3的转录,我们随后利用免疫共沉淀及细胞免疫荧光技术证实了此假设。免疫共沉淀结果发现LPS可以促进p65NF-κB与Snail形成蛋白复合体,细胞免疫荧光结果发现此蛋白复合体定位在细胞核内,这初步说明LPS可以促进p65NF-κB与Snail在核内形成蛋白复合体,以共同调控HK3的转录。综上所述,我们得出以下结论:1、LPS可以促进结直肠癌细胞炎症小体的活化进而促进细胞的迁移和侵袭。2、LPS可以促进结直肠癌细胞的葡萄糖消耗及乳酸产生。3、LPS通过NF-κB/Snail-HK3信号通路上调结直肠癌细胞的糖酵解水平,进而促进细胞的迁移和侵袭。