机体的免疫应答是一个十分复杂的过程，由多种免疫细胞和免疫分子（膜分子和可溶性分子）参与并受到严格的调控。近来的研究表明，一组细胞膜分子即共刺激分子（costimulatory molecules）的调节性表达、相互作用及其信号传导在免疫应答过程中起着十分重要的作用。其中B7:CD28家族被认为是最基本的共刺激分子，B7家族主要由B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、B7RP-1等组成；CD28家族主要由CD28、CTLA-4和ICOS等组成，它们均属共刺激分子免疫球蛋白超家族成员。表达在抗原递呈细胞（antigen presenting cells, APCs）上的B7与表达在T细胞上的CD28相结合，其介导的共刺激信号为T细胞活化、增殖和产生效应所必需。共刺激分子的发现和共刺激信号学说的建立，促使一些新的免疫治疗策略、方法及生物制剂应运而生并迅速得到证实和运用。通过增强共刺激信号，有利于肿瘤的排斥和肿瘤细胞的杀伤；而阻断共刺激信号，则可诱导T细胞特异性免疫耐受的产生，有助于自身免疫性疾病或超敏反应及异体移植排斥的防治。鉴此，进行共刺激信号激动剂或拮抗剂的研制及其在B7:CD28信号传导中的调节作用研究，具有十分重要的意义。 B7CD28激动剂l桔抗剂的研制及其在共刺激信号传导中的调节作用研究 中文摘要 一．抗人 B71oD80）mAb的研制及其生物学特性的鉴定 l．杂交瘤细胞的建株 以人多发性骨髓瘤wltiple peloma，MM）细胞转人B7八基因细 胞株XG B7和小鼠纤维母细胞转人B7上基因细胞株LE7为免疫原， 将其用丝裂霉素仰Mq处理60 V引X m’细胞）后，免疫B ALALBC 小鼠＊ ＊只＼ 分颈部皮下多点及腹腔注射。采用 B淋巴细胞杂交 瘤技术，将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞即川（或X63） 进行杂交，采用聚乙二醇中olyethylene glycol，PEG）为融合剂。经 HAT选择培养，以XG B7、LB7为抗体筛选阳性细胞株；以转基因 细胞的母本细胞作为阴性对照细胞株。经多次的克隆化培养及反复筛 选，最终获得1株持续、稳定分泌鼠抗人B7JKD80）niAb的杂交瘤 细胞株（IYinb4ES人经体外长期培养和液氮冻存后复苏，杂交瘤细 胞生长良好，分泌抗体的性能稳定。 2．mAb的生产及纯化 采用体内诱生腹水法进行InAb的生产，其腹水形成的阳性率平 均为80％，腹水的收获量平均为7．gml／只。经免疫亲和层吸法对腹水 型 ITmb进行纯化，用 751紫外分光光度计进行蛋白定量。纯化后腹 水中Illi，b蛋白的得率平均为2．18mg／ffil。 3．mAb的亚朔效价测定 快速定性试纸法的分析结果显示，hab4ES属小鼠IgGI亚类、 将腹水型IILAb和纯化后的InAb蛋白用PBS梯度稀释后，与XGIB7 细胞反应，洗涤后，再与羊抗鼠IgGIITC反应，用流式细胞仪用ow cytometry FCM）分析。腹水型抗体用于间接免疫荧光标记细胞的稀释 度为 1：1000以上，纯化后 InAb蛋白用于间接免疫荧光标记细胞的 用量为 lp gis叶 XIO’细胞。 6 B7汇D28激动剂胎抗剂的研制及其在共刺激信号传导中的调节作用研究 中文柄要 4．mAb识别的抗原位点 采用两种单抗与抗原竟争结合的抑制实验方法进行分析，即先将 InAb4ES与反应细胞XGIB7于4℃结合45min。洗涤后，再与藻红素 OE）直接标记的阳性对照鼠抗人B7J（Immunotech公 司）反应，用FCM进行分析。结果显示，＂b，b4ES能完全阻断阳性 对照＂LAb与相应抗原的结合，提示InAb4ES与阳性对照IlL，b识别 相同或相似的抗原位点。 5．mAb ＄r＄＆在不同细胞上B7＊ 的识别与结合 采用兔疫荧光法分析了hab4ES与体外细胞因子诱导的树突状 细胞u＊曲d。比k＊O＊人外周血单个核细胞①＊＊C人人B细 胞性恶性淋巴瘤细胞 Rat和 Daudi上 B7分子的识别与结合能力＊CM 分析的结果表明，InAb4ES与 DC、PBMC、Rat和 Daudi的阳性结 合率分别为 95．l％、10．20、92．70和 89．20，与阳性对照 ITLAb的结 合率相当，提示IYulb4ES具有良好的特异性和亲和力。当将叫 和 Daudi细胞分别以 1J的比例与 PBMC混合后，ITL，b4ES与其的阳性 结合率分别为 45＊％和 42．9％，表明 mAb4ES能特异地识别靶细胞上 的相应抗原分子，提示该抗体在相关肿瘤的辅助诊断和治疗后残留细 胞的监控中，可能具有潜在的临床应用价值。 H．鼠抗人 CD28 mAb的研制及其生物靴性的鉴定 二．杂交瘤细胞的建株 以小鼠恶性淋巴瘤细胞转人CD2