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海洋是药物的宝库,近年来,随着海洋生物学研究的不断深入,发现许多海洋藻类含有多种特有的天然的药用活性物质。藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中,是藻胆蛋白的重要组分,在螺旋藻中的含量较高。研究表明,PC具有抗炎症、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等生理活性,为螺旋藻在保健和药用领域的开发提供重要的依据。
百草枯(Paraquat,PQ),是目前世界范围内应用最广泛的除草剂之一。随着在我国农业上的广泛应用,PQ中毒也日趋增多。PQ对人畜均有较强毒性,致死剂量小,发展快且无特效解毒药物,临床上病死率很高。肺为PQ中毒的主要靶器官,大剂量中毒常由于急性肺损伤所致的呼吸衰竭及心、肝、肾等多脏器功能衰竭而死亡;较小剂量的中毒往往引起迟发性的肺纤维化,病程相对较长,晚期多死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭。传统的糖皮质激素和细胞毒药物长期应用副作用大,疗效并不理想。因此寻找行之有效的治疗药物是目前医疗界迫切需要解决的问题。
PQ的中毒是多系统、多器官、多水平的,中毒机制尚未完全阐明,但多数学者认为,其中毒机制在于氧化损伤。PC能有效地清除氧基自由基,有较强抗氧化能力,对小鼠或大鼠炎症模型具有明显的抑制作用。这些活性作用对PQ中毒有潜在的治疗效果。目前,海洋药物尚未用于中毒治疗学研究,本课题研究的主要目的旨在研究PC对抗急性PQ中毒引起的急性肺损伤和肺纤维化作用,以期为临床救治和探索海洋药物治疗急性中毒提供科学依据。
本研究首先对钝顶螺旋藻中的PC进行了提取和纯化。采用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超生波破碎法,50%硫酸铵沉淀获得PC,提取率达到13.2%。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱(HA)层析和sephacrylS-200HR凝胶层析对其进行纯化,纯度比(A620/A280)达到4.75。
然后我们对PC抗PQ诱导肺纤维化进行了研究:
(1)肺组织病理变化:①苏木精伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining,HE):模型(PQ)组1-7d以急性肺泡炎为主要表现,3d时炎症表现最重,14-28d成纤维细胞增生,大量肺泡结构萎陷、破坏,胶原沉积,肺纤维化初步形成。PC组各观察点病理变化和模型组相似,但程度较轻。早期(3、7d)即肺泡炎期,肺泡渗出、细胞浸润少,中后期(14、28d)即肺纤维化进展和纤维化期,在胶原沉积,肺纤维化进展程度轻。②马松三色(Masson)染色:28d时模型组可见较多蓝色胶原沉积于支气管壁及肺泡间隔,蓝染面积百分比较对照组有显著性差异(P<0.01)。PC组蓝染胶原沉积较少,蓝染面积百分比较PQ组差异有显著性(P<0.05)。③电镜:PQ组:早期可见肺泡Ⅰ型上皮细胞受损,纤毛脱失,基膜断裂,肺泡腔内有大量水肿渗出液,多见巨噬细胞,间质炎性细胞浸润;后期可见到肺泡间隔增厚,内含大量增生、肥大的肺泡n型上皮细胞,板层小体空泡化,多见异型核,肺泡隔内弹性纤维、胶原纤维和网状纤维多,胶原纤维增生明显。PC治疗后PQ中毒大鼠肺组织超微结构表现为肺泡炎及纤维增生减轻。
(2)血清和肺组织均浆丙二醛(MDA)含量变化:染毒后,染毒大鼠血清和肺组织均浆MDA含量均明显升高(P<0.01),PC治疗后,各观察点PC组MDA含量升高程度明显低于PQ组(P<0.01)。
(3)肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量变化:染毒后,染毒大鼠肺组织均浆HYP含量均明显升高(P<0.01),PC治疗后,各观察点PC组HYP含量升高程度明显低于PQ组(P<0.01)。
(4)血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力变化:染毒后,染毒大鼠血清中GSH-Px活力均明显降低(P<0.01),PC治疗后,各观察点PC组GSH-Px活力明显高于PQ组(P<0.01)。
(5)血清和肺组织均浆超氧化物歧化酶(SOD)活力变化:染毒后,染毒大鼠血清和肺组织中SOD活力均明显降低(P<0.01),PC治疗后,各观察点PC组SOD活力升高,与PQ组相比差异显著(P<0.01)。
(6)肺组织均浆细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)的蛋白水平变化:染毒后,染毒大鼠肺组织中TGF-β1的蛋白水平均明显升高(P<0.01),PC治疗后,各观察点PC组TGF-β1的蛋白水平降低,与PQ组相比差异显著(P<0.01)。
(7)肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)的影响:染毒后,染毒大鼠肺组织中TNF-α的含量均明显升高(P<0.01),3d时肺组织中TNF-α的含量最高,其后逐渐降低,28d时肺组织中TNF-α的含量最低。各观察时间点,PC组大鼠肺组织中TNF-α的含量均低于染毒组(P<0.01)。NF-κBp65的结果与TNF-α相似,7d时肺组织中NK-κBp65的含量最高,其后逐渐下降。各观察时间点,PC组大鼠肺组织中NK-κBp65的含量均低于染毒组(P<0.01)。结果表明:PC可以提高肺组织SOD和血浆GSH-Px、SOD活性,降低肺组织HYP、MDA和血浆MDA含量,降低肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1的蛋白水平,抑制NF-κB亚基p65及TNF-α活性,减轻PQ中毒大鼠肺泡炎及后期纤维化程度,对PQ诱导的大鼠肺泡炎及肺纤维化具有显著的抑制作用,对PQ中毒有较好的治疗效果。该研究将为海洋药物治疗PQ中毒致肺纤维化提供新的思路。