近年来,随着抗生素的大量运用,耐药菌的加剧出现成为严重影响人类健康的一个重要安全问题。产超广谱β内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases,ESBL)菌株1983年被Kliebe.C首次报道后,国际上对其的关注日益增多。产ESBL菌株在患者体内、畜牧、家禽、昆虫和环境中的不断检出,尤其是新型产ESBL菌株的不断发现,都提示产ESBL菌株业已成为当前的一类广泛流行的微生物,并已经和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA),耐万古霉素肠球菌(Vancomycin resistant Enterococcus,VRE)一并成为目前临床上威胁最大的三大菌株。产ESBL菌株主要为革兰氏阴性杆菌,大多数通过质粒介导。由于革兰氏阴性杆菌繁殖速度快,细菌群体效应密切,因此导致编码ESBL的质粒在菌株之间的转移相对阳性菌株更加容易,且发生变异的机会也更大。目前,世界上已经发现了近300多种编码ESBL基因(bla基因),这类菌株的耐药谱提示此类菌株的耐药类型几乎覆盖了目前所有的常用抗生素,其造成的感染会给临床治疗带来极大的困难。水环境作为耐药基因传播的媒介,其庞大的耐药基因库,为进入该环境中的致病菌及条件致病菌提供获得大量耐药基因的机会,一旦这些致病菌再次入侵人体,引起感染,将会造成难以预计的后果。耐热大肠菌群作为水中致病菌的指示菌,具有易培养,易鉴别,数量众多的优点,可以客观地反映水中菌株的耐药情况。同时,由于耐热大肠菌株来源于温血动物的肠道,同肠道固有菌群具有遗传上的相似性,因此在细菌间交流对话和基因交换方面具有更加便利的条件,这样也会造成耐药型耐热大肠菌群成为耐药基因的储存库,通过基因转移将耐药基因传递到其他菌株,形成潜在的健康危害。本课题将从水中的产ESBL耐热大肠菌株为切入点,研究其在地表水中的分布情况,耐药特点及耐药相关基因元件的携带规律,并通过耐药基因的体内转归规律研究,探讨水中产ESBL菌株在水环境中的卫生学特点,以及此类菌株在进入人体后可能带来的健康危害,为控制水源性耐药菌的污染,预防耐药菌引起的介水传染病,保障公共卫生安全提供科学依据。一、水中产ESBL耐热大肠菌群耐药谱及耐药基因型研究我室前期已经发现,医院污水是地表水中的产ESBL菌株的主要来源,由于医院污水中的耐药菌具有致病菌多,耐药谱广的特点,我们推测,医院污水中产ESBL菌株在进入地表水体后,其所携带的耐药相关基因元件将会在阴性菌株中发生散播,造成耐药菌株的大范围扩散。因此,了解水中产ESBL菌株的菌种、耐药谱特点和产ESBL耐药基因型特点,对于掌握重庆地区长江地表水中产ESBL菌的污染水平,以及其可能造成的耐药性扩散危害,将提供十分重要的背景数据。本实验从从长江地表水重庆市区段2公里的江面上,于2007至2009年分三次采集水样,分离水中耐热大肠菌群,通过产ESBL确证实验获得产ESBL耐热大肠菌,使用细菌菌种鉴定系统鉴定样本菌株菌种,测定对一线常用19种抗生素的MIC值,并使用特定的引物,PCR检测TEM、SHV、CTX-M和OXA四种产ESBL基因的携带情况。本实验共从重庆段长江地表水收集得到1914株水源性耐热大肠菌群,其中342株对头孢噻肟耐药,经过产ESBL确证实验共获得319株产ESBL菌株,占水中耐热大肠菌的16.7%。所有菌株均呈现多重耐药性,对19种一线抗生素有不同程度耐药,仅对阿米卡星和亚胺培南敏感率较高,通过分析样本菌株的bla基因型发现,CTX-M是水中产ESBL耐热大肠菌的主要的bla基因型,但是菌株以复合基因型为主要构成主体,同本地临床报道有较大差距。其中CTX-M+TEM占有较大比例(30.4%),其次是CTX-M+SHV(9.1%)和SHV+TEM(6.0%),未发现OXA基因型。结果显示,重庆段长江地表水中产ESBL菌株污染情况较为严重,呈现耐药谱广,耐药基因型复杂的特点,提示此类菌株在水中可能成为耐药基因的主要储存载体,地表水环境可能成为耐药基因重新组合的重要场所。二、水中产ESBL耐热大肠菌群中整合子携带情况研究整合子是细菌特别是革兰阴性菌基因中,一种能识别且俘获移动性基因盒,并有位点特异性的重组表达系统的可移动基因元件(mobile gene elements,MGEs)。整合子本身无法移动,但常出现在转座子,接合性质粒,噬菌体或细菌染色体上,共同作为可自行移动的载体,捕获和整合耐药基因,形成巨大的多基因座(loci) ,并随细菌的繁殖复制到子代DNA中。其所携带的基因盒可以编码对多种抗生素的耐药性,因此整合子被认为是同菌株多重耐药密切相关的一类MGEs。目前已知的整合子可以分为1、2、3、4类,其中1类整合子被认为在耐药基因的转移过程中占主要作用。本课题在前期发现产ESBL菌株呈现高度的多重耐药趋势的基础上,结合此类菌株对非产β-内酰胺类抗生素也具有较高的的耐药比例的特征,推测水中产ESBL菌株可能和整合子有着密切的联系,因此研究水中产ESBL菌株中整合子的的携带规律,对于掌握产ESBL菌株多重耐药的原因和特点,摸清此类菌株的耐药规律,揭示其可能产生的卫生学危害,具有重要意义。通过对产ESBL耐热大肠菌进行1、2、3类整合酶扩增,并扩增和测序分析整合酶阳性菌株中耐药基因盒区域,发现319株样本菌株中,含有1类整合子比例较高,达65.2%。仅有3株菌株携带有2类整合子,未发现3类整合子的存在。3株携带2类整合子的菌株同时也携带1类整合子。通过分析整合子包含的耐药基因盒区域发现,208株整合酶阳性菌株中,共有117株整合子阳性菌株携带有耐药基因盒区域,具有9种不同的片段长度,其余菌株未检测到扩增产物。通过对扩增产物进行测序分析共检测到13种耐药基因盒,其中aadA家族和dfrA家族是产ESBL菌株中最常见的耐药基因盒,1.8kb片段中dfrA17-aadA5的耐药基因盒组合形式出现频率最高,且序列片段大小相对固定。结果提示,1类整合子在产ESBL菌株中存在几率较高,整合子中携带的耐药基因种类广泛,可能是造成此类菌株的多重耐药性的重要原因。耐药基因盒区域的相对固定表明,整合子在产ESBL菌株中可能作为一个保守的固有元件,进行整体传播,形成耐药性的扩散,整合子的保守性可能使其成为储存耐药基因的重要形式。三、水源性产ESBL菌株在小鼠肠道内的定植情况研究水中产ESBL耐热大肠菌群由于其分布广泛,且通过前期研究证明对氯制剂具有一定的抗性,常规的消毒方式无法完全杀灭水中的产ESBL菌株,可能通过饮水进入到人体肠道当中。此外,在一些容易接触到污水的职业人群,如污水处理厂工人、渔民等,以及卫生条件较差的农村地区,通过消化道感染此类菌株的机会更大。耐热大肠菌群来源于动物肠道,同肠道固有菌和致病菌之间都有着密切的遗传背景联系。当此类菌株进入人体肠道后,可能在肠道中定植下来,使得人体肠道菌群成为耐药菌的保存宿主,并可能通过耐药基因的扩散造成更为严重的健康危害,形成远期的健康威胁。因此,研究水源性产ESBL耐热大肠菌在肠道内的定植的规律,对于防控耐药菌污染,预防肠道菌群失调,有着十分重要的卫生学意义。本课题中,我们通过模拟相当于清洁泉水、长江地表水、和医院污水水体中产ESBL菌株浓度的饮水,使小鼠自由饮用,用含头孢噻肟的m-FC培养基进行粪便中耐药菌株的检测和鉴定。研究发现,当饮水中产ESBL菌浓度相当于长江地表水水平时,小鼠正常接触该饮水6h,即可在粪便中检测到耐药菌的存在,说明在该浓度下接触污染饮用水,耐药菌可以顺利通过小鼠肠道并排出体外。在停止接触污染饮用水3d后,小鼠粪便中仍能继续检测到耐药菌的存在。各浓度饮水组小鼠在停止接触细菌后,粪便中耐药菌检出率逐步趋同,维持在103 CFU/g粪便水平,可稳定排出一定时间。通过RAPD方法对检出菌株进行分析,发现粪便中的耐药菌既存在饮水中存在的污染菌,又有获得耐药基因而产生耐药性的肠道固有菌菌,因此可以说明外源性产ESBL菌株在进入小鼠肠道内后,可以在小鼠肠道内定植下来,并提示肠道固有菌群通过捕获外源性细菌的质粒,获得其所携带的耐药基因,成为新的产ESBL耐药菌株。由于固有菌株在肠道内可以长期稳定的存在,因此可能造成肠道内固有菌群的耐药性提高,当受到抗生素选择压力时,造成肠道内菌群结构的改变,带来一定的健康危害。同时,外源性耐药基因可能通过在肠道内固有菌的存量作用,形成基因的扩散和复制,排除体外后引起更为广泛的耐药基因污染。研究结果显示,水源性产ESBL耐热大肠菌进入动物肠道后可以持续复制并通过粪便排出体外,肠道环境对于耐药菌具有储存和放大的作用。此发现提示,水源性产ESBL耐热大肠菌对于人体肠道存在一定的健康危害,需要加强对饮水安全的监控,提高饮水中耐药菌的杀灭效果,防止介水传染病的发生。四、用于研究耐药基因肠道转移的新型小鼠模型的建立耐药基因在肠道内基因转移一直是科学家们研究的重点,但是由于肠道菌群的种类繁多,菌落数量难以计算,使得肠道菌群内耐药菌相关实验的设计成为一个难以突破的瓶颈。在体外实验中,研究人员已经成功地实现了不同菌株、菌种甚至菌属之间的基因转移,但是在肠道内如何将此类研究变得可控化、可视化一直难以解决。本课题受到Babic发表于08年SCIENCE[1]上的文章启发,尝试从直接可视化层面对肠道内目标菌株进行改造,使得肠道内固有菌株在稳定生长的前提下,具有简单易行的可视化检测方法,结合抗生素耐药性可以快速筛选出捕获有外源性耐药基因的接合菌株,从而方便与计算和评价外源性耐药基因对肠道固有菌的影响作用。我们通过将编码绿色荧光蛋白的gfp基因从pGFPuv质粒中提取出来,然后连接到pET28a+原核表达载体当中,构建成重组质粒pET28aGFP质粒,并将此质粒通过转染ArcticExpress感受态菌株,证实此重组质粒能够在宿主菌株中稳定表达绿色荧光。然后从小鼠肠道各肠段提取优势固有耐热大肠菌株,根据实验需要选择合适的菌种和耐药谱,然后通过基因重组将我们构建好的重组质粒整合到固有菌株当中,再通过饲喂菌株使得重组菌株在小鼠肠道内定植。通过检测粪便中发光菌的数量发现,我们构建的此种小鼠模型能够稳定从体内稳定排出发光重组受体菌株,并持续排出7d以上,可以说明构建的此种小鼠模型能够用于肠道菌株耐药基因的转移研究,为后续的耐药基因体内转移研究提供了较为实用的实验平台。五、水源性产ESBL菌株所携带耐药基因在小鼠模型内的转移规律研究以往的报道显示,对于小鼠肠道内耐药基因转移的研究,更多的是通过检测粪便中耐药菌的存在来推断,而缺乏对整个肠道系统而具体的了解,其转移频率也因为区分接合菌株困难而在统计上存在一定难度。我们在前期成功构建小鼠肠道菌群模型的基础上,利用各个肠段的优势菌群指示菌株作为受体菌,研究当水源性产ESBL耐热大肠菌进入小鼠肠道后,所携带的耐药基因想指示菌株转移的规律,对于揭示肠道内环境对于耐药基因转移的影响,以及外源性耐药基因在肠道中的转归提供了一定的实验依据。研究发现,当水源性产ESBL菌株进入肠道后,在部分肠段内发生了耐药基因的转移。但是在胃、十二指肠和空肠上段中,均未能检测到耐药基因转移现象,说明酸性环境可能对耐药基因转移有一定抑制作用。肠道耐药基因转移在结肠内检出频率较高,且各类型产ESBL菌株之间无明显差异,说明结肠环境由于菌群密集,菌株数量多,菌体停留时间长,使得耐药基因的转移几率增大,甚至高于体外转移水平,提示肠道菌群中最有可能受到外源性耐药基因影响的菌群集中在结肠环境内,当肠道菌群受到抗生素影响时,可能会引起结肠的肠道菌群失调。分子生物学证据表明,获得了耐药基因的受体菌株同造模中使用的受体菌株具有同样的基因型,证明了(1)前期建立的小鼠模型能够成功运用于产ESBL菌株的肠道转移实验当中,具有良好的操作性;(2)水源性产ESBL菌株在进入肠道后,能够将所携带耐药基因转移给肠道固有菌,形成耐药基因的扩散,并可能通过肠道固有菌对耐药基因的保存,形成稳定持续的耐药基因生产场所。六、结论和创新点长江作为重庆的主干水流,已经受到产ESBL耐药菌的严重污染,水中耐药菌的检出水平远远高于其他地区。产ESBL耐热大肠菌呈现高度的多重耐药特点,对于目前临床和畜牧业上常用的一线抗生素均有不同程度的耐药,其中整合子可能在多重耐药性上发挥了重要作用。通过体内实验我们证实,水中产ESBL耐热大肠菌由于其适应肠道生活环境,且同肠道菌群之间关系密切,因此在进入动物肠道后能够定植并繁殖,并通过粪便持续性排出体外。同时,水源性产ESBL菌株还可以将所携带的耐药基因转移给肠道固有菌,形成耐药菌种类扩散,结肠环境是发生基因转移的重要场所。本课题提示,需要严格控制污染源中耐药菌的排放水平,加强对地表水中耐药菌的监控力度,进一步加强对饮水安全的措施保障,为防止耐药菌在水环境中的扩散,预防介水传染病的发生提供有力支持。重庆作为一个长江上游地区发达的综合性城市,其耐药菌的产生和排放严重影响长江的水质。长江为重庆城区的主要饮水来源,且是下游三峡库区的重要主干水流,长江水中的菌株耐药情况同人群的健康关系密切。本课题在目前国内首次关注长江地表水中产ESBL耐热大肠菌的背景资料,并通过耐药谱、整合子、肠道定植、耐药基因转移等实验,从多个方面客观阐述了此类菌株在水中的分布特征及对动物肠道菌群的潜在危害,具有一定的现实意义。同时,本课题也是国内外率先通过重组肠道固有菌构建用于研究耐药基因体内转移的动物模型,并通过实验证实具有一定的应用效果,为耐药基因的相关研究提供了一定的科学依据和实验积累。七、问题与展望:本研究仅针对水源性耐热大肠菌群进行研究,而产ESBL菌株所涵盖的范围极广,不但包括了肠杆菌科,还包括了拟杆菌、假单胞菌等,因此仅仅研究肠杆菌科中耐热大肠菌群的产ESBL菌株特性还不能说明水中整体耐药菌株的特性。此外,我们在研究中发现,虽然临床报道表明2类整合子在临床分离株中携带比例也在一个较高水平,但是我们的样本菌株中仅发现3株菌株携带有2类整合子,提示耐热大肠菌株可能对于1类整合子有偏好,而较少的捕获2类整合子。因此,后期如果能对耐热大肠菌株对于1类整合子的捕获偏好机制进行研究,将有助于了解耐药基因捕获和转移的更深层次规律。同时,相比临床菌株,产ESBL菌株对1类整合子的捕获率明显较高,从菌株层面上考虑,是否此类菌株更容易识别外源性耐药基因,或者是否存在一定的分子机制使得此类菌株对于外源性耐药基因的整合和利用更加便捷,也是我们值得继续深入研究的一个重要方面。