研究背景甲状腺乳头状癌（PTC）是最常见的内分泌恶性肿瘤,近几十年其发病率在全球急剧上升[1]。在结节性甲状腺疾病患者中,血清促甲状腺激素（TSH）可作为甲状腺恶性肿瘤诊断的独立预测因子已被许多临床证据指出。良性甲状腺结节的TSH水平明显低于甲状腺乳头状癌[2-4]。甲状腺乳头状癌与高TSH的相关性已被广泛研究,甚至有学者指出可以将TSH作为甲状腺微小乳头状癌（直径＜1cm）的风险评估指标[5]。但也有一些研究显示并未观察到TSH水平与甲状腺微小乳头状癌存在相关性[6,7]。事实上,TSH在引发甲状腺癌方面的因果作用尚未得到完全证实[8]。目前的这些临床研究有一个共同的缺陷,即所采用的回归方法仅仅能够证明TSH与甲状腺癌存在相关性,但未采用合适的方法,如孟德尔遗传学研究,证明二者之间是否存在因果关系,因此无法证明TSH是甲状腺癌的诱因[9]。肿瘤环境是决定肿瘤生物学特性的关键因素。细胞因子作为肿瘤环境中的重要组成部分,在肿瘤的发生和发展过程中发挥着独特的作用。Dachshund homolog 1（DACH1）是视网膜决定基因网络（RDGN）中的一个重要组成部分,可以通过和其他因子直接结合或相互作用来调节靶基因的表达[10-13]。一般情况下,DACH1作为肿瘤抑制因子,抑制乳腺癌、肺癌、肾癌、前列腺癌等的生长和转移[14,15]。与在多种实体癌中作为肿瘤抑制因子的作用不同,DACH1似乎在血液系统恶性肿瘤中起着癌基因的作用[16]。DACH1在不同癌症中的不同作用可能反映了RDGN在特定细胞系中的独特作用,并强调了细胞环境特异性分子相互作用在癌症发生和进展中的重要性。研究目的鉴于临床数据结论与实验室检查结果之间的不一致性,我们推测:1.TSH仅仅是PTC调控网络中的一员,尚存在其他因子和通路在PTC发生发展中发挥着至关重要的作用。2.TSH与甲状腺乳头状癌之间可能并非单纯的正相关,很可能存在双重效应。为了排除其他潜在的干扰,进一步探究单纯的TSH在PTC中的作用,本研究的实验一通过体外培养甲状腺原代细胞及乳头状癌细胞系,观察给予TSH后甲状腺滤泡上皮细胞及甲状腺乳头状癌细胞的多种生物学变化,以期为更深入的探讨TSH在PTC中的作用提供理论依据。寻找DACH1可以调节激素信号的其他的细胞类型有助于探讨其病理生理功能。除了乳腺、前列腺和卵巢外,垂体、甲状腺、内分泌胰腺和其他几种激素反应细胞也表达DACH1,然而DACH1在这些组织中的功能仍不确定。为了探究DACH1在甲状腺乳头状癌中的表达及其作用,本研究的实验二通过检测DACH1在甲状腺乳头状癌患者病理标本的表达以及改变甲状腺乳头状癌细胞系的DACH1表达水平,来观察DACH1对甲状腺乳头状癌生物学活性变化的影响,以期进一步探讨DACH1在甲状腺乳头状癌中的作用与意义。研究方法和研究结果1.提取大鼠甲状腺原代细胞并培养,给予不同浓度的TSH（0 m U/L、5 m U/L、10m U/L、20 m U/L、40 m U/L、80 m U/L）处理72小时后,与对照组相比,各浓度的处理组中BRAF的m RNA表达均出现了不同程度的下调。2.给予Nthy-ori-3-1细胞和TPC-1细胞不同浓度的TSH（0 m U/L、5 m U/L、20 m U/L）处理72小时后,与空白组相比,TSH处理组细胞增殖指数下降,各浓度组之间增殖指数无明显差异。3.流式细胞术结果显示,在Nthy-ori-3-1细胞和TPC-1细胞中受到20 m U/L的TSH处理后,G2/M+S期所占比例降低（P＜0.05）,提示细胞增殖受到抑制。4.高通量差异分析TSH处理前后的结果显示:Nthy-ori-3-1细胞中,差异基因主要在核糖体相关通路、传染病、病毒相关以及信号转导的差异基因富集数量较多;在TPC-1细胞中,差异基因主要在肿瘤相关通路以及细胞转运、分解代谢的差异基因富集数量较多。经TSH处理后,除了具有促癌作用的CXCL8表达下调外,多种趋化因子如CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CCL2、CCL20、CCL28表达都出现明显降低。5.ELISA和实时荧光定量PCR结果显示:经TSH处理后,Nthy-ori-3-1细胞的CXCL8及CXCL12下降、CXCL10升高;TPC-1细胞的CXCL8下降、CXCL10升高。6.Western blot结果表明经TSH处理后,Bcpap细胞BRAFV600E表达下降、Nthy-ori-3-1和TPC-1细胞BRAF的表达下降、Nthy-ori-3-1细胞和Bcpap细胞DACH1表达升高,且Bcpap细胞和TPC-1细胞DACH1表达与TSH处理时间相关。7.DACH1在甲状腺乳头状癌病理组织的免疫组化结果显示:DACH1在癌与癌旁组织的表达量有显著差异（P=0.002）。不同亚组进行的分析中,在＜45岁、女性以及I-II期三个亚组中,癌与癌旁组织中的DACH1表达有显著差异（分别为P=0.046、P=0.017、P=0.016）。对照不同个体时发现,DACH1在不同的样本中表达水平个体差异较大,但癌组织DACH1表达量高于癌旁组织。8.Western blot结果显示在三个甲状腺细胞株中,DACH1表达水平为Nthy-ori-3-1﹥Bcpap﹥TPC-1。根据该结果选择沉默基础表达量高的Nthy-ori-3-1细胞内DACH1,转染p CMV-3×FLAG-DACH1质粒上调基础表达量低TPC-1细胞内DACH1,对基础表达量居中的Bcpap细胞分别进行上调及下调DACH1。9.利用si RNA下调Nthy-ori-3-1细胞DACH1表达水平后,细胞增殖增多、凋亡减少、细胞迁移能力显著增强。根据ELISA和实时荧光定量PCR结果,转染组细胞内CXCL10水平下降,CXCL8和CXCL12水平上升。10.改变Bcpap细胞中DACH1的表达水平,结果反映过表达后Bcpap细胞增殖受到抑制、而沉默组Bcpap细胞增殖增加;过表达后凋亡增加、沉默后凋亡减少;过表达DACH1后迁移力减弱、反之沉默DACH1后增强。根据ELISA和实时荧光定量PCR结果,过表达组CXCL8和CXCL12水平下降,沉默组CXCL8和CXCL12水平升高、CXCL10水平降低。11.将DACH1过表达质粒转染进TPC-1细胞后,结果反映出DACH1过表达组TPC-1细胞增殖减少、凋亡增加、迁移能力下降。根据ELISA和实时荧光定量PCR结果,过表达组CXCL8和CXCL12水平下降,CXCL10变化无统计学意义。结论本研究结果提示TSH在甲状腺癌进程中可能并非关键致癌因子。TSH对甲状腺的致癌作用需要更加深入的探讨。我们推测,在甲状腺癌的病理进程中,TSH可能同时具有促癌和抑癌双重作用,而其对甲状腺癌细胞命运的影响则是由于促癌和抑癌平衡的破坏,最终决定甲状腺细胞结局向何方向发展。实验结果显示DACH1在每个患者甲状腺癌旁组织表达的基础水平差异较大,但在癌组织中DACH1表达均高于同一个体的癌旁组织。例如,有的患者癌旁组织DACH1表达呈“-”、癌组织呈“+”,而有的患者癌旁组织呈“++”、癌组织呈“+++”。这也就解释了在检测三个细胞系中DACH1表达基础水平所出现的现象:Nthy-ori-3-1（甲状腺正常细胞系）内DACH1的表达之所以会高于Bcpap和TPC-1（甲状腺乳头状癌细胞系）,可能是由于三个用于建系的个体之间DACH1表达存在差异所致。而经过对三株甲状腺/甲状腺癌细胞系转染干预DACH1表达水平之后的实验结果显示,DACH1可参与调节细胞内趋化因子CXCL8、CXCL10及CXCL12水平,上调DACH1可在一定程度上抑制细胞增殖和迁移,并对细胞凋亡起到促进作用。这些实验结果提示DACH1在甲状腺乳头状癌中可能呈抑制肿瘤作用,这与DACH1在乳腺癌、肺癌、肾癌、前列腺癌等中的作用一致[14,15]。