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为了更好地揭示DNA甲基化相关基因与菊花性状之间的联系,本研究利用酶切-连接法对菊花CmDRM2、CmCMT3和CmDME基因的保守区进行RNA干扰载体的构建,并尝试建立菊花叶盘再生体系,期望能够获得菊花转基因植株。同时也利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术尝试揭示菊花在盛花期时不同组织部位CwDRM2、CmCMT3、CmDME和CmMET1基因的表达模式,并分析转基因菊花植株中,其他DNA甲基化相关基因的相对表达量。以下是本研究的主要结果:(1)菊花CmDRM2、CmCMT3和CmDME基因保守序列的获得本研究在寻找菊花CmDRM2、CmCMT3和CmDME基因保守序列的过程中,每一家族基因分别参考了 9个物种的相应基因,获得了 3个菊花DRM2类等位基因,2个CMT3类等位基因和4个DME类等位基因。通过对获得的菊花中的9个DNA甲基化基因与其他物种中相关基因的聚类分析,结果表明菊花的3个DRM2类等位基因,2个CMT3类等位基因和4个DME类等位基因分别与其他物种的DRM2类、CMT3类和DME类基因聚合在一起。这进一步证明了我们所获得基因为目标基因。另外,我们利用DNAMAN软件分别对以上3类基因作同源比对,获得了菊花中DRM2类、CMT3类和DME类基因的保守区域,长度分别为1868 bp、722 bp和1096/181 bp。根据它们的保守区域设计引物,分别以菊花品种“南农丽雅”、“南农红袖”、“紫蝶翻飞”、“紫精灵”、“国庆红”和“神马”的cDNA为模板,并进行PCR扩增,测序。再次利用DNA MAN软件进行分析得出:菊花CmDRM2、CmCMT3和CmDME基因保守序列在6种菊花品种的同源性均为100%。(2)菊花CmDRM2、CmCMT3、CmDME和CmMET1基因的表达模式分析利用RT-PCR技术分别对CmDRM2、CmCMT3、CmDM和CmMET1基因在菊花“南农丽雅”的花瓣、茎段、叶片、根和脚芽中的表达量进行分析得出:CmDRM2基因在菊花组织部位的表达量从高到低的组织部位的分别为茎段、花瓣、根、叶片、脚芽;CmDME基因在菊花组织部位的表达量从高到低的组织部位分别为茎段、花瓣、脚芽、根、叶片;CwCMT3基因在菊花花瓣和茎段中的表达量相近,在根中表达量次之,而在叶片和脚芽中的表达量最低;CmMET1基因在菊花茎段和叶片中的表达量较高,而在花瓣、根和脚芽中的表达量较低。其中,菊花CmDRM2和CmDME基因在茎段中的表达量均远远高于在其他部位的表达量。在菊花5个组织部位中,CmDRM2基因的表达量均大于CmDME基因,而CmDME基因的表达量均大于CwCMT3和CmMET1基因。(3)RNA干扰载体的构建通过分步酶切-连接法分别构建了菊花CmDRM2、CmCMT3和CwDME3类基因的RNA干扰载体,并分别通过了菌液PCR和双酶切验证。(4)菊花叶盘法遗传再生体系的建立利用正交试验设计菊花叶盘法再生培养基,共配制9种培养基,每次3个重复,共重复3次,并利用SPASS软件进行统计分析得出:菊花“紫蝶翻飞”叶盘最适培养基为MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉+1.0 mg/L6-BA+0.75 mg/LNAA,分化率为 71.1%;菊花“南农丽雅”和“南农红袖”叶盘最适培养基均为MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA,分化率分别为100%和80%。(5)菊花CmDRM2和CmCMT3基因的RNAi载体的叶盘遗传转化利用农杆菌介导法转化菊花CmDRM2和CmCMT3基因的RNAi干扰载体,得到的再生植株,通过卡纳霉素标记筛选鉴定和RT-PCR定量分析鉴定,得出:获得菊花CmDRM2转基因植株10棵,CmCMT3转基因植株3棵。(6)菊花转基因植株的相对表达量分析CmDRM2-RNAi转基因植株的CmDRM2的相对表达量与对照组相比平均下调了61.14%;CmCMT3-RNAi转基因植株的CmCMT3的相对表达量与对照组相比平均下调了46.19%;在CmDRM2-RNAi转基因植株中,DNA甲基转移酶基因CmCMT3和CmMET的相对表达量与对照相比均有所上调,分别平均上调了 42.88%和11.14%,而DNA脱甲基酶CmDME基因的相对表达量比对照有所下调,平均下调了 30.76%;在CmCMT3-RNAi转基因植株中,DNA甲基转移酶基因CmDRM2和CmMET1的相对表达量与对照相比均有所上调,分别平均上调了 19.75%和5.85%,而DNA去甲基化酶CwDME基因的相对表达量比对照有所下调,平均下调了 41.88%。无论是菊花CmDRM2-RNAi转基因植株还是CmCMT3-RNAi转基因植株中的其他DNA甲基转移酶的表达均呈上调状态,而DNA去甲基化酶CmDME基因均呈下调状态。