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甘蔗黑穗病是甘蔗生产上造成严重危害的一种病害。为了研究其病原菌的致病机理，本研究应用根癌农杆菌介导真菌转化技术成功地建立了甘蔗鞭黑粉菌的遗传转化体系，通过17批次的转化已构建了拥有11034个转化子的突变体库，经有性配合试验筛选到8个有性配合能力缺陷的突变体，对其中3个有性配合能力完全丧失的突变体A2130、A3993，B803，采用hiTail-PCR技术获得相关基因全长序列，并对突变体A2130进行了致病性测定及所突变基因的RT-PCR分析；同时，应用同源克隆技术和同源重组技术，成功克隆甘蔗鞭黑粉菌交配型bE基因全长序列和编码区全长，构建了bE基因敲除载体，利用根癌农杆菌介导甘蔗鞭黑粉菌转化技术对bE基因进行同源敲除，并经有性配合和致病性测定试验验证了该基因的功能。主要研究结果如下：
(1)对甘蔗黑穗病标样进行采集、病原分离，并对分离得到的单倍体进行随机配合，鉴定出“+”、“-”交配型单倍体菌株，选取菌株WT17和WT18为本研究农杆菌介导甘蔗鞭黑粉菌遗传转化受体。
(2)通过一系列试验，确立了农杆菌介导甘蔗鞭黑粉菌最佳遗传转化技术体系：潮霉素最佳使用浓度为200μg/ml，头孢霉素筛选最佳浓度为300μg/ml，乙酰丁香酮(acetosyingone，AS)最适合的浓度为400μmol/L，农杆菌最佳的诱导时间为6 h，黑粉菌适宜培养时间为12-14 h、孢子浓度为107cfu/mL，诱导培养基pH5.6，共培养时间为72 h。该体系的转化效率较高，平均可获得150个转化子/皿。
(3)通过对17批次转化获得的11034个转化子与相对性系野生交配型菌株进行的有性配合试验及Southern blot验证，最终筛选得到8个有性配合能力缺陷且是单拷贝插入的突变体。其中，4个突变体完全丧失有性配合能力，另外4个突变体有性配合能力明显减弱。利用hiTAIL-PCR扩增出8个有性配合能力缺陷突变体的翼侧基因序列，获得了其中3个完全丧失有性配合能力的突变体A2130、A3993及B803的相关基因全长序列，并对突变体A2130进行了致病性测定和所突变基因的RT-PCR分析，初步验证了所突变基因的功能。
(4)利用生物信息学方法对由突变体A2130、A3993及B803分离获得的有性配合相关基因进行了分析。由突变体A2130分离得到的有性配合相关基因命名为us-Chs，在NCBI数据库Protein Blast中预测全长序列的蛋白保守结构，发现该基因具有细胞色素b5超级家族(Cyt-b5 superfamily)和脂肪酸羧化酶超家族(Fatty acid hydroxylasesuperfamily)两个保守域；其中，细胞色素b5超家族中包含几丁质合成酶保守域；该基因全长1179 bp，编码392个氨基酸，脂肪系数为85.33，总平均亲水性为-0.114，属于疏水蛋白。从突变体A3993中分离到全长2967 bp的序列，经NCBI比对发现存在与玉米黑粉菌521菌株中的Pep1基因和固醇转运蛋白sterol carrier protein基因同源的两个基因，T-DNA插入位点处于下游基因(编码sterol carrier protein的基因)的启动子区和上游基因(Pep1)的终止区。Pep1是U.maydis在菌丝入侵寄主时起着关键作用的致病因子，而sterol carrier protein则与调控细胞内脂质的循环和新陈代谢相关。由突变体B803分离获得4424 bp的序列在NCBI上进行blast比对后，发现与茭白黑粉菌(U.esculenta)核糖体rRNA基因同源，同源率达98％。该序列包含3个同源区域分别为28S ribosomal RNA、intergenic spacer(IGS)和18S ribosomal RNA，T-DNA插入位点处于核糖体间隔区intergenic spacer(IGS)。
(5)通过同源基因克隆技术获得了甘蔗鞭黑粉菌两个交配型WT17和WT18 bE基因全长序列和编码区全长序列，同时利用同源重组技术成功实现了对bE基因的敲除。WT17 bE基因的全长为1498 bp，其cDNA为1401 bp，由467个氨基酸编码组成；WT18的bE基因全长为1510 bp，cDNA为1413 bp，由471个氨基酸编码组成；WT17bE基因与WT18 bE基因序列同源率达94.1％，cDNA同源率达93.8％，两者均含有一个相同的内含子、一个可变区的N-末端区域和一个高度保守C-末端区域，两个基因总平均亲水性均为-0.492，说明该蛋白是一个疏水蛋白。构建了bE基因敲除载体，对野生型bE基因进行同源双交换敲除，获得bE基因敲除突变体，经有性配合及致病性试验验证了该基因的功能，确是有性配合和致病的关键基因。