1、WAP抗菌肽的表达与功能研究;2、家蝇proPO系统关键基因的鉴定与表达分析

来源 :济南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chenshunsheng
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无脊椎动物没有获得性免疫,只有先天性免疫,而先天性免疫包括细胞免疫和体液免疫,抗菌肽和proPO激活系统则是体液免疫的两种重要组成成分,在昆虫的免疫系统中发挥重要作用。本文主要研究了wap抗菌肽和proPO激活系统,对抗菌肽在真核生物体内的功能以及体外表达进行了研究,对proPO激活系统中的关键基因进行了定位与分类,并对其表达模式进行了初步的探索。  本文利用果蝇这一遗传背景清晰的真核生物,将外源wap基因导入果蝇体内,构建了UAS-wap转基因果蝇品系。并利用遗传变异法对wap在UAS-wap转基因果蝇品系中的染色体位置进行了基因定位,得到了wap分别插入在转基因果蝇性染色体、第二染色体、第三染色体基因型的品系,将它们与actin-Gal4果蝇杂交,实现了wap基因在它们杂交后代果蝇中的过表达,通过QPCR检测发现,wap基因在mRNA水平的表达量明显高于对照,有的达100多倍。并对wap抗菌肽在转基因果蝇体内的抗菌功能进行了探究与验证,并获得了明确的抗菌效果。该结果为新型抗菌药物的研发奠定了良好的基础。  随着大家对抗菌肽的重视程度越来越高,已经有人用原核表达系统在体外成功的获得了WAP重组蛋白,并且测得其有明显的抗菌活性,但是WAP抗菌肽在真核表达系统的体外表达还未曾有人成功。本文对WAP抗菌肽在真核表达系统的表达做了研究,成功的构建了wap/pPIC9K重组表达载体,获得了含有wap/pPIC9K重组质粒的真核表达菌株。另外针对目前原核表达获得的WAP抗菌肽都是以包涵体形式存在的、不利于WAP生物活性的发挥及利用这一技术难题,我们想要找到一种可以高产量的获得可溶性WAP的方法,因此本实验室进行了WAP的原核表达。构建wap/pET32a/Rosetta重组表达菌株,通过体外诱导表达,获得了可溶性的 WAP抗菌肽重组蛋白。获得可溶性的 WAP抗菌肽是一大技术上的突破,同时也为WAP抗菌肽早日实现工业化生产奠定了技术基础。  同时体液免疫中的另一大免疫因子 proPO激活系统的研究也逐渐引起了科学界的重视,目前国内外对proPO激活系统的全部成分都还不清楚,本实验室着重研究了proPO激活系统中的几个关键基因:酚氧化酶原(proPO)、激活酶(PAP)、抑制因子(Serpin)、受体因子(PGRP)。对这些关键基因进行了鉴定与分类,并对其表达模式进行了初步的分析。  本文通过转录组测序、序列分析与基因克隆技术,筛选出家蝇Serpins类、PAP类基因的Unigeen,并对其进行序列拼接、验证、分析和结构与功能预测,初步将Serpins类分为11类,PAP类分为3类。并对Serpin基因在家蝇幼虫不同发育时期的表达模式进行了分析,对PAP基因在家蝇幼虫体内的功能进行了初步探讨。这能够为家蝇proPO系统激活机制和免疫功能的研究提供科学资料,对揭示家蝇独特而有效的免疫机制、寻找关键的免疫功能分子和发展有效的防治害虫与严重人畜传染性疾病的新方法,具有重要的理论和实际意义。
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