论文部分内容阅读
目的:除本底之外,宇宙探索、核能开发、医疗照射等活动均使人类有更多的机会暴露于低水平的辐射环境。低剂量辐射生物学效应一直以来都是放射医学研究的一个热点。近年来的研究发现了几个特殊的低剂量效应,这些效应包括适应性反应、旁观者效应、基因组不稳定性和低剂量超敏感现象等。其中辐射低剂量超敏感现象是指低剂量电离辐射(< 0.5Gy)单位剂量的细胞杀伤比高剂量时更有效,这被称为“辐射超敏感性”(Hyper-Radiosensitivity, HRS),此后,随着照射剂量的增加,细胞对电离辐射的抵抗性逐渐增强,直到1Gy为止,这随后的效应被称为“诱导的辐射抗性”(Induced Radioresistance, IRR),因此辐射低剂量超敏感现象也称为HRS/IRR现象。HRS/IRR现象目前主要集中在体外低LET射线的细胞杀伤效应方面的研究,其机制认为是与ATM基因有关。该现象在高LET射线中研究较少。重带电粒子(重离子)因其不同于其它粒子和射线的物理学特性,较常规的Χ、γ射线和电子束等在肿瘤治疗方面有更明显的优越性。目前许多国家都已经开始考虑将重离子束(主要为碳离子束)作为今后临床肿瘤放射治疗的一种新手段。在这种治疗模式下,受照射的肿瘤部位被置于Bragg峰处,从而在肿瘤接受较大剂量情况下,其前方正常组织接受较小的剂量。本课题的研究目的为初步探讨暴露于低水平碳离子束辐射下的正常细胞是否存在超敏感的现象,以及这种现象的发生机制,为今后采用碳离子束治疗肿瘤时的方案制定以及相关防护提供一定的基础研究资料。方法:第一部分:低水平碳离子束照射人正常细胞的超敏感现象研究采用传统的克隆形成实验检测受低水平碳离子束照射后细胞的存活分数,采取克隆法检测受照细胞的hprt基因位点突变频率。首先采用低水平Χ射线照射正常人皮肤成纤维细胞GM0639(GM细胞,ATM+/+)。在确认其存在低剂量超敏感现象的基础上,选择0.05~2Gy照射剂量范围的碳离子束(能量:290 MeV/nucleon,LET:70 keV/μm,剂量率:0.5 Gy/min),观察GM细胞在低水平碳离子束照射下的细胞存活分数和hprt基因位点突变频率指标是否存在HRS/IRR现象。另外还观察了低水平碳离子束照射下ATM缺陷型的人皮肤成纤维细胞AT5BIVA(AT细胞,ATM-/-)各检测指标是否存在超敏感现象,以初步探索低水平碳离子束照射下HRS/IRR现象的作用机制。第二部分:重离子照射所致超敏感现象ATM相关机制的探讨首先,选用ATM激活剂,Chloroquine,或者ATM抑制剂,KU55933在碳离子束照射前处理GM细胞,随后用低水平碳离子束进行照射,观察受照后细胞的存活分数和hprt基因位点突变频率指标的HRS/IRR现象是否仍存在。采用Western blotting方法观察ATM的表达随着照射剂量变化的情况,初步确认ATM是否可能参与低水平重离子束HRS/IRR现象的发生机制。其次,根据之前相关机制的报道,结合ATM蛋白具有调控细胞周期以及DNA修复的两个最基本功能,通过这两方面来进一步探讨ATM是如何在其中发挥作用的。细胞周期调控:采用免疫荧光染色结合流式细胞仪的方法,观察Histone H3-pS10随着不同的照射剂量以及不同的照射前预处理而变化的情况,通过计算有丝分裂指数,反映“早期”G2调控点的阻滞情况;同时还采用流式细胞仪观察细胞周期的分布,反映照射后一定时间G2/M调控点的阻滞情况。并且还采用Western blotting检测周期调控相关基因的表达情况。DNA修复调控:首先采用免疫荧光染色的方法,观察γ-H2AX荧光焦点(foci)的数目随不同的照射剂量以及不同的照射前预处理而变化的情况,反映DNA双链断裂的修复效率与HRS/IRR现象发生的关系;同时,根据DNA双链断裂的两条修复路径,同源重组(HR)和非同源末端联接(NHEJ),分别采用Western blotting、免疫荧光染色法观察两条路径的代表性蛋白Rad51和DNA-PKcs的表达情况和荧光焦点的变化情况,以探讨这两条路径在HRS/IRR现象发生中所起的作用。第三部分:初步探讨低水平碳离子束引起的超敏感现象可能的新机制采用基因芯片技术,筛选碳离子束HRS发生剂量和IRR发生剂量在GM细胞接受照射后不同时间的差异表达基因,为该现象机制的研究寻找新的、可能的方向。结果:首先,通过低水平X射线照射对存活分数进行软件拟合,同时以ATM基因缺陷的细胞作为对照,确定了正常人皮肤成纤维细胞GM0639存在低剂量超敏感现象。进而发现,GM细胞受低水平碳离子束照射后细胞存活分数和hprt基因位点突变频率均存在HRS/IRR现象,HRS出现的剂量分别为0.2Gy和0.17Gy附近,IRR则出现在0.5Gy附近。ATM缺陷的人皮肤成纤维细胞AT5BIVA受低水平碳离子束照射后则不存在HRS/IRR现象。低水平碳离子束照射前采用ATM修饰剂预处理的GM细胞HRS/IRR现象均消失。其中,ATM抑制剂照前处理可引起IRR的消失,而ATM激活剂的照前处理则导致HRS的消失。同时还发现,ATM的活化水平,即ATM-pS1981的蛋白表达水平会随着照射剂量的增加而增加,表现出与HRS/IRR转换的一致性,即0.2Gy照射剂量下,ATM的活化水平较低,会随着剂量照射而迅速增加,至0.5-0.7Gy以上则增加缓慢。另外,本课题还发现,ATM依赖的“早期”G2调控点与低水平碳离子束HRS/IRR现象有关,其机制可能涉及ATM以及ATM下游基因,如Chk2、p53等;低水平碳离子束照射后DNA双链断裂的修复效率低,可导致细胞死亡以及突变效应出现HRS现象。NHEJ和HR修复路径中的代表性蛋白均在一定程度上依赖于ATM,因此在低水平照射条件下因为ATM没有被完全活化,也会影响到这两条路径正常发挥作用。最后,为进一步研究机理,通过基因芯片技术筛选出一些重离子束低剂量照射和高剂量照射后不同时间差异表达的基因,包括细胞周期、细胞增殖、DNA修复、自噬等基因的改变。结论:首先,确认了在本课题的照射及实验条件下,受碳离子束照射正常人皮肤成纤维细胞GM0639在低水平照射范围内,细胞存活和hprt基因位点突变频率指标均存在HRS/IRR现象;其次,ATM及其相关的“早期”G2调控点、DNA双链断裂修复等可能参与低水平碳离子束所致HRS/IRR的机制;最后,低水平碳离子束所致HRS/IRR的发生,可能还存在其它相关机制。