第一部分肝脏淤血再灌注损伤的机制研究引言肝移植是拯救终末期肝病的唯一有效手段。随着肝移植需求的逐年增加,供肝短缺的现状也日趋明显,严重制约其发展。活体肝移植技术成为解决供肝匮乏难题的有效方法,拓展了肝移植的适应证,技术上日臻完美,并获得与全肝移植媲美的疗效。包含中肝静脉的右半供肝在为成人受体提供更多有功能肝实质的同时也增加了供体肝衰的风险。不包含中肝静脉的右半供肝虽能很好地平衡分配供受体的肝体积,但其主要桎梏为右肝前叶潜在的静脉回流障碍导致的肝脏淤血。为了确保供体安全,多数中心提出改良右半肝活体肝移植的术式,即选择不含中肝静脉的右半供肝,采用血管移植物来重建中肝静脉的属支。这种方法在供肝获取和植入过程中,必须阻断右肝前叶汇入中肝静脉的分支,虽然重建流出道,但难以避免右肝前叶长时间的淤血,造成一种特殊类型的移植肝损伤——淤血再灌注损伤,导致肝窦淤血、肝细胞坏死和微循环障碍,使得移植肝有效体积减少,对于术前一般情况较差的受体,可能直接导致小肝综合征,严重影响预后。在肝移植手术过程中,呼气末正压和中心静脉压过高会引起肝静脉回流障碍,肝窦内血流淤滞,造成明显的肝脏淤血情况。在肝胆外科急诊肝破裂手术中经常难以避免损伤肝静脉,以及复杂肝脏切除手术中医源性意外缝扎肝静脉导致的肝脏淤血。肝脏淤血再灌注损伤将导致肝脏组织细胞发生一系列代谢、结构和功能的紊乱,直接影响移植术后肝功能的恢复、手术成功率和患者生存率。现今,在移植领域对于肝脏缺血再灌注损伤的机制已进行了深入地研究,建立了热缺血和冷缺血模型,但仍缺乏对肝静脉回流障碍引起的肝脏淤血再灌注损伤内在机制的研究。本研究目的在于阐明肝脏淤血再灌注损伤中肝细胞损伤和微循环障碍的病理生理过程,为下一步寻找有效干预措施提供理论依据。材料和方法(1)动物分组：清洁级选用近交系C57BL/6(H2b)小鼠。将实验动物随机分为3组(假手术SO、缺血再灌注IR和淤血再灌注CR),术后2、6和24小时每个时点各6只小鼠。IR模型：无损伤血管钳阻断左肝前叶(LAHL)的门静脉和肝动脉入肝血流,75分钟后开放血流；CR模型：(1)10-0线缝扎LAHL的回流静脉,75分钟后松解缝线开放血流。阻断之前需全身肝素化(2U/g)。(2)肝功能检测：血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)采用全自动生化分析仪测定。(3)肝组织髓过氧化物酶(MPO)活性检测：按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书操作。(4)组织学：肝脏组织经福尔马林固定后,行石蜡包埋、切片,HE染色,行光镜组织学观察肝细胞肿胀、空泡变性、细胞破坏、核溶解、细胞结构消失,判断肝组织坏死程度。(5) TUNEL法测凋亡：利用商品化试剂盒行TUNEL染色,比较各组在平均每个高倍视野的TUNEL阳性细胞数,判定肝细胞的凋亡程度。(6)肝脏微循环：在体荧光显微镜检测。异硫氰酸酯荧光标记的右旋糖酐标注红细胞检测微血管灌注率。罗丹明-6G标记白细胞定量分析白细胞在肝窦和窦后静脉内的流动变化。选取以下指标：①肝窦未灌注率：血流未灌注肝窦/肝窦总数×100%。②粘附白细胞：粘附于肝窦和窦后静脉内皮,静止30秒及以上者。随机选取10个高倍镜视野计数平均每个高倍镜视野粘附于肝窦上的白细胞数量。③滚动白细胞：静止30秒以内者,随机选取与肝窦相连的10个窦后静脉,分别计算每分钟和每毫米静脉壁上滚动白细胞的数量。(7) real-time PCR测炎症因子：选取50-100mg肝组织,采用Trizol试剂盒提取总RNA,测定RNA260/280nm的吸光度,判定其完整性和纯度。按逆转录酶说明书将3μg总RNA逆转录成cDNA。取cDNA加入ABI PRISM7500Real-Time PCR扩增仪,SYBR Green用作PCR扩增反应。用目的基因与β-actin的比值表示目的基因的相对表达水平。(8)统计方法：数据采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验和方差分析。以P<0.05为差异有显著性。结果(1)肉眼观IR组阻断LAHL的入肝血流后,肝叶颜色变白,去除阻断钳后,颜色恢复红润。CR组阻断LAHL的回流静脉后,LAHL颜色进行性变暗,60秒内肝叶变得肿胀,与临床的肝淤血十分相似,松解结扎线后,肝叶的颜色逐渐恢复红润,肝叶表面留有散在的淤血灶,再灌注2小时后淤血灶逐渐消褪。再灌注6小时和24小时后,LAHL和正常肝叶无明显差别。(2)肝功能IR组和CR组再灌注后ALT和AST均明显增高,2小时达到高峰,到24小时开始减退。与IR组相比,CR组的ALT和AST在再灌注后2小时表达显著增高(ALT:884.2±200.5vs.459.7±149.1U/L, AST:792.5±93.5vs.520.8±124.2U/L,P<0.05),再灌注后6小时仍增高但无统计学差异(ALT:604.0±187.4vs.498.8±199.9, AST:703.5±162.6vs.584.2±204.9, P>0.05),到24小时两者水平相当。(3)MPOCR组和IR组的MPO活性在再灌注后2小时迅速增高,随着再灌注时间延长而减少。 CR组在再灌注后24小时, MPO表达显著高于IR组(0.34±0.11U/g vs.0.15±0.04U/g, P<0.01)。(4)组织学和TUNEL肝脏HE染色显示IR组表现为空泡变性、中度肝细胞坏死及中性粒细胞侵润；CR组表现为更明显的中度肝细胞空泡变性、坏死并伴有局部肝窦淤血。TUNEL染色发现SO组极少见凋亡细胞(0.3±0.2阳性细胞数／高倍视野),IR组和CR组再灌注后2小时凋亡细胞显著增多,但两组凋亡程度相似(2.7±0.6vs。2.8±0.9阳性细胞数/高倍视野,P>0.05)。(5)肝脏微循环①肝窦未灌注率：在体荧光显微镜显示IR组和CR组肝脏微循环灌注障碍,与SO组肝窦未灌注率(2.5±0.85%)相比,IR组和CR组的肝窦未灌注率明显升高,其中再灌注后2小时,CR组明显高于IR组(27.4±1.97%vs.23.8±1.93%, P<0.05)。CR组在中央肝窦的血流灌注明显低于周围肝窦。②粘附白细胞和滚动白细胞：CR组内皮细胞同白细胞的相互作用增强,促进白细胞的激活和粘附。再灌注后各时间点,CR组窦后静脉内的滚动白细胞和粘附白细胞数量明显增加,CR和IR两组间在肝脏微循环白细胞数量上无明显差异。(6)细胞因子与SO组相比,CR组和IR组再灌注后2、6和24小时,IL-1β、MCP-1、IL-6和TNF-α均显著增高。CR组和R组相比,TNF-α和IL-6无明显差异,而IL-1β在再灌注后6小时,MCP-1在再灌注后2、6小时显著增高。结论肝脏淤血再灌注损伤引起肝细胞损伤和微循环障碍的严重程度高于缺血再灌注损伤,其发生与肝窦内压增高、血液返流,直接损伤肝窦内皮细胞导致功能紊乱；肝窦内血栓或微血栓形成；肝窦灌注率下降,窦内白细胞堆积并激活,释放大量炎症因子相关。第二部分肝脏淤血再灌注损伤保护措施的机制研究引言活体肝移植作为一种解决供肝匮乏难题的有效方法,技术上日臻完美,并获得可与全肝移植媲美的疗效。但由于肝脏静脉系统的独特性,活体肝移植技术上难以避免中肝静脉回流障碍,致部分肝叶淤血的弊端,致使有效肝实质减少,严重者发生小肝综合征,直接导致移植失败。多数中心采用血管架桥作重建淤血肝段流出道,这就势必造成肝脏淤血再灌注损伤(CRI)。我们在小鼠肝脏CRI模型上发现CRI导致的肝脏微循环障碍和肝细胞破坏程度远高于缺血再灌注损伤(IRI),其发生与肝窦内压增高、血液返流,直接损伤肝窦内皮细胞导致功能紊乱；肝窦内血栓或微血栓形成；肝窦灌注率下降,窦内白细胞堆积并激活,释放大量炎症因子相关。尽管治疗肝脏IRI的各种手段和药物已在实验和临床中进行广泛的研究和应用,但目前仍缺乏对CRI保护措施的研究。大量临床和动物实验已证实缺血预处理(IPC)对肝脏IRI具有保护作用。在IRI模型上,IPC可能通过改变细胞能量代谢、减轻炎性细胞浸润、促进肝脏再生和调节促炎因子等发挥作用,但具体机制尚未明确。HO-1具有抗氧化、抗炎、维持微循环,从而保护肝细胞的作用。HO-1的表达依赖于转录因子Nrf2的激活,Nrf2为细胞内氧化还原反应的主要调节因子。在生理状态下Keap1与Nrf2结合使其活性处于相对静默状态。在氧化应激源的作用下,Nrf2和Keap1解除偶联后入核与ARE结合,启动ARE调控的抗氧化基因HO-1的表达。因此,Nrf2/HO-1信号通路是重要的抗氧化、保护细胞的途径。本研究假设IPC作用于肝内非实质细胞,上调Nrf2/HO-1信号通路,从而起到减轻CRI的作用。材料和方法(1)动物模型及分组：清洁级选用近交系C57BL/6(H2b)小鼠。将实验动物随机分为3组：假手术(Sham组)、淤血再灌注损伤(CRI组)、缺血预处理+淤血再灌注(IPC+CRI组)和淤血预处理+淤血再灌注(CPC+CRI组)。再灌注后2、6、24、48小时和7天取标本,每个时间点各6只小鼠。CRI组：10-0线缝扎左肝前叶(LAHL)的肝静脉,完全阻断LAHL回血,75min后松解缝线开放血流；IPC+CRI组：预先阻断LAHL的入肝血流10min,再开放血流灌注10mmin后制造CRI。CPC+CRI:预先阻断LAHL回流静脉造成淤血10mmin,再开放血流灌注10mmin后制造CRI。阻断之前小鼠需全身肝素化(2U/g)。(2)肝功能检测：血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)采用全自动生化分析仪测定。(3)肝组织髓过氧化物酶(MPO)活性检测：按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书操作。(4)组织学：肝脏组织经福尔马林固定后,行石蜡包埋、切片,HE染色,行光镜组织学观察肝细胞肿胀、空泡变性、细胞破坏、核溶解、细胞结构消失,判断肝组织坏死程度。(5) TUNEL法测凋亡：利用商品化试剂盒行TUNEL染色,比较各组在平均每个高倍视野的TUNEL阳性细胞数,判定肝细胞的凋亡程度。(6) real-time PCR测炎症因子：选取50-1OOmg肝组织,采用Trizol试剂盒提取总RNA,测定RNA260/280nm的吸光度,判定其完整性和纯度。按逆转录酶说明书将3μg总RNA逆转录成cDNA。取cDNA加入ABI PRISM7500Real-Time PCR扩增仪,SYBR Green用作PCR扩增反应。用目的基因与β-actin的比值表示目的基因的相对表达水平。(7)统计方法：数据采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验和方差分析。以P<0.05为差异有显著性。结果(1)肝功能与CRI组相比,IPC-CRI组ALT的表达在2、6小时明显改善,2小时(839.2±132.5vs.384.2±94.8,P<0.01),6小时(680±142.4vs.342.3±99.7,P<0.01),到24小时以后两者水平无明显差异。然而,与CRI组相比,CPC-CRI术后肝功能损伤加重,ALT表达增高：2小时(839.2±1325vs.1087.5±192.5,P<0.05),6小时(680±142.4vs。626.7±140.9,P>0.05),表明CPC与IPC不同,对CRI无治疗效果。(2)组织学和TUNELCRI组HE染色显示超过30%～60%的肝脏细胞发生空泡样变性,肝窦轻微扩张,肝买质内炎性细胞浸润明显。与CRI相比,IPC-CRI组肝脏淤血性损伤明显减轻,不足30%的肝脏细胞发生空泡样变性,肝窦扩张不明显,未见明显的炎性细胞浸润,Suzuki评分较CRI组明显下降(2小时：3.2±0.4vs.1.8±0.4；6小时：3.2±0.3vs.1.7±0.5,P<0.05)。另一方面,CPC-CRI组表现为更严重的肝脏淤血和坏死,Suzuki评分与CRI组相当(2小时：3.2±0.4vs.3±1.1,P>0.05；6小时：3.2±0.3vs.3.5±0.5,P>0.05)。表明CPC对CRI没有治愈效果,反而加重CRI对肝窦的破坏。TUNEL染色显示CRI组大量凋亡肝细胞,IPC-CRI组肝细胞凋亡明显减轻(2小时：22.0±13.8vs.6.1±1.4,P<0.05；6小时：10.7±6.0vs.4.5±1.1,P<0.05；24小时：12.1±8.5vs.4.3±2.7,P<0.05；阳性细胞数/高倍视野)。(3)MPOCRI组的MPO活性在再灌注后2小时迅速升高,随着再灌注时间的延长而下降。IPC-CRI组在再灌注后2、6小时,MPO表达低于CRI组(2小时：7.1±4.0U/g vs.3.8±1.6U/g, P<0.05;6小时：8.1±1.3U/g vs.5.2±3.0U/g, P<0.05),表明IPC能有效减轻中性粒细胞的侵润。再灌注后24小时两组间无统计学差异。(4)炎症因子Real-time PCR测定炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1和IFN-γ)。与CRI组相比,IPC-CRI组IL-1、IL-6、TNF-α和MCP-1表达在再灌注后24小时均显著下降；其中IL-1和IL-6在再灌注后2、6小时显著下降；两组间IFN-γ的表达无显著差异。(5) Nrf2/HO-1信号通路IPC-CRI组与CRI组相比,Keapl的mRNA表达下降,Nrf2表达增高,激活HO-1的表达。结论肝脏缺血预处理通过上调Nrf2核转录,促进保护因子HO-1的表达,抑制中性粒细胞的激活和炎症因子的释放,减轻肝窦淤血、肝细胞坏死及凋亡,减轻淤血再灌注损伤导致的肝功能损害。本研究为临床改善活体肝移植预后和提高受体生存率提供了新的思路。