论文部分内容阅读
鹅圆环病毒(Goose Circovirus,GoCV)是近年来发现的圆环病毒科的一个新成员。与其他圆环病毒一样,鹅圆环病毒常潜伏感染,但往往侵染淋巴细胞等增殖速度快的细胞,引起免疫力下降,导致动物对多种条件性病原二次感染的易感性增加。
根据已发表的鹅圆环病毒序列,设计了一对检测引物,对浙江永康禽流感病死鹅样品进行PCR扩增,获得与预期552 bp大小相符的DNA片段,经测序、BlastN比对确认为GoCV特异序列,推测样品中存在GoCV。根据测定的序列进一步设计反向扩增引物,经扩增、测序、拼接后获得GoCV全长基因组序列。
基因组序列分析表明,浙江永康株GoCV—yk01全长1821bp,具有圆环病毒共同的与病毒复制相关的茎环结构和Rep蛋白保守基序等特征,它与德国、中国台湾发表的序列在全基因组水平有91%~93%的同源性,在Rep和外壳蛋白的氨基酸水平有94%~97%的同源性。应用ClustalW方法作进化树分析显示,GoCV—yk01序列与德国株及中国台湾株均不在同一分支。
设计一对引物,将去除了N端部分序列的外壳蛋白(ΔCap蛋白)基因克隆到原核表达载体pET—28a的His标签下游,进行His—ΔCap融合蛋白表达。经过IPTG诱导后,SDS—PAGE检测出与预期大小(27.6 kDa)相符的目的蛋白,通过BandScan软件分析,重组ΔCap融合蛋白的表达量为18.3%,Western blot分析表明ΔCap蛋白能与His单抗特异反应。将ΔCap蛋白用镍琼脂糖凝胶纯化、复性后测得其纯度为78.5%。用差速离心法从GoCV阳性群鹅法氏囊组织中提取GoCV病毒并将其与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,制备了兔抗GoCV多克隆抗体,经琼扩试验检测效价为1:16。用表达的重组ΔCap蛋白包被酶标板,用兔抗GoCV多抗和鹅血清中的GoCV抗体竞争该抗原,初步建立了检测鹅血清GoCV抗体的间接竞争ELISA法。试验表明该方法的最佳抗原包被浓度为8.9μg/ml;兔抗GoCV抗体的稀释度为1:400;最佳封闭液为5%的脱脂奶粉;最佳显色时间为20分钟;对于该方法的临界值的确定尚需进一步研究。该方法的建立对GoCV诊断、防控等研究提供了基础。