病原微生物入侵子宫组织的成败受到子宫内膜完整性的直接影响。以肠外致病性大肠杆菌为首的病原微生物入侵产后奶牛子宫内膜组织造成的炎性损伤是引起奶牛不孕的重要原因。奶牛子宫内膜炎性损伤（Endometrial Inflammatory Injury,EII）的修复及其重建过程受到多方面因素的干预。IFN-τ作为反刍动物特有的I型干扰素的一种,具有调节并维持子宫内免疫微环境稳态的功能。本实验室前期研究已经证实,IFN-τ对脂多糖诱导小鼠肺组织炎性损伤作用具有保护作用;可介导小鼠子宫内先天免疫反应改善局部炎症状态。然而,对奶牛子宫内膜组织的炎性损伤是否具有保护作用,与损伤相关模式分子是否有关联性没有明确的报道;尤其是IFN-τ通过对靶基因的转录后调控作用干预奶牛子宫内膜炎性损伤的分子机制研究较少。本研究通过构建离体奶牛子宫内膜组织和奶牛子宫内膜上皮细胞（BEND或b EECs）,以及小鼠子宫内膜炎性损伤模型。应用荧光定量等分子生物学方法揭示IFN-τ抑制HMGB1/NF-κB信号通路的活性,缓减b EECs炎性损伤的调节机制;另外,利用高通量测序技术筛选出IFN-τ干预下奶牛子宫内膜上皮细胞中特异性miRNAs的表达谱。探究IFN-τ通过miRNA对靶基因的转录后调控作用介导HMGB1/NF-κB信号通路对奶牛子宫内膜组织炎性损伤作用的保护机制。为开拓IFN-τ的临床应用价值及筛选治疗奶牛子宫内膜炎性损伤的分子靶标奠定科学的理论依据,本研究主要结果如下:1.体外培养奶牛子宫内膜组织,通过H&E染色观察组织结构形态完整,无明显腺体脱落现象,成功培养了奶牛子宫内膜组织,并应用5、10、20μg/m L的LPS刺激子宫内膜组织建立炎性损伤模型。实验结果显示,当LPS的刺激浓度为10μg/m L时,与对照组相比较,炎性因子m RNA表达水平明显增加,主要包括三种,分别为IL-6和TNF-α以及IL-1β。通过免疫组织化学分析得到,LPS刺激下的b EECs中TLR4和HMGB1蛋白表达量显著增加;同时TUNEL实验结果证明,奶牛子宫内膜组织细胞的调亡率增加。IFN-τ浓度在25、50和100 ng/m L时,以浓度依赖方式抑制模型组IL-1β、IL-6和TNF-α的表达;并筛选出IFN-τ的最佳干预浓度为50 ng/m L。另外,IFN-τ以浓度依赖性的方式显著抑制模型组TLR4和HMGB1蛋白的表达水平,同时显著增加ZO-1和Occludin蛋白表达水平。IFN-τ抑制HMGB1和TLR4的表达进而抑制NF-κB信号通路的活性,促使IKBα和p65蛋白磷酸化水平下降。此外,实验结果显示50 ng/m L的IFN-τ可显著减少Bax表达,相反,Bcl-2表达被提高;对于组织细胞调亡具有显著的抑制性。而IFN-τ浓度为100 ng/m L时,无显著抑制细胞凋亡作用。研究结果表明,IFN-τ对奶牛子宫内膜组织的炎性损伤的保护作用,主要通过抑制HMGB1的表达而实现。2.通过建立bEECs炎性损伤模型的研究证明,其中炎性因子表达被抑制。免疫印迹实验证明IFN-τ显著抑制HMGB1的表达和p-IKK和p-p65的表达水平;同时,免疫荧光研究发现NF-κB p65的核易位被抑制。另外,用si-HMGB1转染b EECs阐明了HMGB1在子宫内膜上皮细胞炎性损伤级联反应中的关键作用。实验结果也说明了IFN-τ对HMGB1/NF-κB信号通路的抑制作用,进而起到保护b EECs的炎性损伤过程。此外,通过构建BALB/c小鼠子宫内膜炎性损伤模型也获得了同样的研究结论。3.高通量测序结果证明,在IFN-τ的作用下,b EECs中保守的特异性miRNA表达谱发生显著性变化。其中,在LPS刺激下miRNA表达呈上调和下调两种趋势;与对照组相比模型组中显著下调的miRNA有bta-miR-182、bta-miR-505、bta-miR-488和bta-miR-31。但在IFN-τ的干预下,bta-miR-505表达量显著上调,而bta-miR-182、bta-miR-488和bta-miR-31上调不明显;同时使用R软件中的phyper函数对miRNA的靶基因功能进行富集分析发现其参与细胞内信号转导,并具有双向调节作用。KEGG注释揭示差异表达miRNA靶基因主要参与细胞生命进程,并介导先天免疫调节参与细胞复制和修复。4.临床表现为子宫内膜炎性损伤组织和小鼠子宫内膜炎性损伤组织以及LPS诱导的b EECs炎性损伤中miR-505表达量均显著下调;然而IFN-τ的干预使的miR-505的表达显著上调。过表达miR-505可显著抑制炎性损伤的b EECs中,炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达以及IκBα和p65蛋白磷酸化。同时双荧光酶基因报告系统与si-HMGB1基因沉默实验结果揭示在调控HMGB1的表达方面,miR-505负调控HMGB1,同时对IκBα磷酸化产生抑制作用,对p65核易位起到一定的阻滞。另外,过表达miR-505与靶基因的si RNA干扰显著缓解了LPS诱导的b EECs周期阻滞和凋亡反应;免疫印迹结果提示,Bcl-2/Bax比值增加;活化的caspase-3和caspase-9表达量下降。结论:IFN-τ上调miR-505表达靶向HMGB1,抑制NF-κB通路的活性,通过抑制b EECs炎性应答反应和细胞凋亡,遏制奶牛子宫内膜组织炎性损伤。