食管癌是世界上常见的六大恶性肿瘤之一,每年全世界新发食管癌病例可达48万人,约有25万发生在中国。我国的食管癌最常见的类型是食管鳞癌,其侵袭性强,进展迅速,且易耐药和复发。　　 干细胞是一种具有自我更新能力,无限增殖,并可分化为成体细胞的细胞。关于干细胞的研究,最初研究的是胚胎干细胞,胚胎干细胞具有全能性,并能分化成各种类型的细胞。近些年,有人提出了肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)学说。该学说认为,肿瘤起源于肿瘤干细胞,肿瘤干细胞具有和成体干细胞相似的特性,如自我更新,无限增殖及多向分化潜能。肿瘤干细胞虽然在肿瘤中占的比例极小,却在维持肿瘤的恶性增殖、侵袭、转移和复发等方面中起着决定性作用。肿瘤干细胞耐受化疗、放疗和低氧。根据肿瘤干细胞理论,若要根治肿瘤,必须消除肿瘤干细胞。深入了解肿瘤干细胞特性,以寻找抑制肿瘤干细胞的方法和途径,将为治愈肿瘤提供新的思路。肿瘤干细胞特性的研究是肿瘤干细胞研究中的重要内容。干细胞特性是干细胞不同于体细胞的一些生物学性质。干细胞特性的变化可通过干细胞因子(干细胞标志物)的变化和一些生物学性状的改变而体现。肿瘤干细胞的鉴定主要是通过其表达的肿瘤干细胞标志物来确定。筛选和鉴定肿瘤干细胞特异性标志物为进一步研究肿瘤的发生、发展、转移和耐药机制提供新的研究途径,为肿瘤的靶向治疗途径提供理论依据。越来越多的研究表明,一些在成体干细胞中表达的因子,如SRY盒2(SRY-related HMG box2,Sox2)、Octamer结合因子3/4(Octamer-bindingfactor3/4,Oct3/4)、人类基因编码的单次跨膜受体蛋白(Notch homolog ltranslocation-associated,Notch1)、CD133(Prominin-1)、三磷酸苷结合转运蛋白G2(ATP-binding cassette transporter G2,ABCG2)等,在肿瘤中也有表达,被认为也是肿瘤干细胞因子。运用这些标志,已经在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤等中鉴定出肿瘤干细胞。　　 实体瘤中,肿瘤的生长速度通常快于血管的生长速度,造成肿瘤内组织缺氧,形成低氧微环境。低氧微环境可引起肿瘤细胞很多生物学特性的改变,如:降低细胞的增殖能力、提高化疗抵抗基因的表达,提高肿瘤的侵入和转移能力、提高基因的不稳定性和阻止DNA基因的修复等。　　 低氧对肿瘤干细胞的影响,主要是通过缺氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)来实现的。HIF是在缺氧状态下,哺乳动物细胞中广泛表达的调控因子,作用是使细胞适应低氧或缺氧的微环境。HIF有2种:HIF-1α和HIF-2α,同为异源二聚体转录因子。HIF能够激活150多个基因的表达,这些基因编码多种蛋白,用于调节细胞代谢、细胞存活、基膜完整性、血管形成以及其它功能。研究表明,低氧也能够调节不同干细胞群体的增生和分化,包括胚胎干细胞、神经和神经嵴干细胞、造血干细胞、滋养层干细胞等;HIF活性能够调节干细胞自我更新和多能性特征,低氧阻止成体细胞分化和阻止肿瘤细胞呈未分化状态而相当于维持肿瘤的干细胞状态。　　 Sox2是胚胎干细胞的一个标志物。Sox2在调控胚胎及组织的发育、维持干细胞的多能性和决定细胞命运方面具有重要作用。研究已证实Sox2是肿瘤干细胞的一个标志物。Oct3/4是控制胚胎干细胞特性的一个关键的转录因子。研究证实Oct3/4也是肿瘤干细胞的一个标志物。Notch1作为肿瘤干细胞的一个标志物,Notch1信号参与维持细胞增殖、存活、凋亡、分化的平衡,从而影响许多器官的生长和功能变化。最近的研究表明,Notch1信号通路在肿瘤细胞化疗抗性产生过程中起着关键性的作用。目前已在多种肿瘤中发现Notch1受体和配体,Notch1或许成为一个与预后相关的肿瘤标志物。CD133最早被证明是造血干细胞的标志,现已被证明是食管癌、脑胶质瘤、肺癌、肠癌、前列腺癌、胰腺癌、骨髓母细胞瘤及黑色素瘤等多种实体瘤的干细胞的标志。CD133与激活干细胞相关的信号通路,抵抗凋亡有关。ABCG2蛋白是一个ABC膜转运蛋白,由于ABCG2基因在某些癌细胞质膜上高表达,从而导致癌细胞将抗癌药物泵出细胞外而产生抗药性。ABCG2转运蛋白首先是从人肿瘤细胞中发现的。目前研究证明ABCG2对于细胞的功能产生影响,可能是一个干细胞标志物。ABCG2在侧群细胞上的专一表达提示其可能成为成体多能干细胞阳性筛选的潜在标志物。用ABCG2作为一个干细胞标志物,筛选食管癌干细胞,至今更未见有关报道。　　 本研究探讨低氧对食管鳞癌干细胞特性的影响,在体外模仿体内的低氧微环境,研究通过RT-PCR、Western blot和流式细胞技术检测在低氧(1％O2)和常氧(20%O2)培养的条件下,食管鳞癌细胞系中KYSE70和KYSE450细胞中干细胞因子表达的变化;通过MTT实验检测ABCG2bright和ABCG2dim生长曲线的变化;通过克隆形成实验检测ABCG2bright和ABCG2dim克隆形成能力的变化,探讨ABCG2是否可作为筛选食管癌干细胞的一个标志物。通过免疫组织化学技术检测食管鳞癌组织中Notch1的表达情况,根据临床资料分析Notch1的表达与临床预后的关系。　　 本研究具体内容共分以下三部分:　　 第一部分低氧微环境对食管鳞癌细胞系KYSE70、KYSE450干细胞特性的影响;　　 第二部分低氧诱导后的食管鳞癌细胞系KYSE70、KYSE450中ABCG2和CD133的表达及肿瘤干细胞样细胞的分离与鉴定;　　 第三部分 Notch1在食管鳞癌中的表达和预后的关系。　　 目的:　　 1.探讨低氧微环境对食管鳞癌细胞KYSE70、KYSE450干细胞特性的影响。　　 2.试探索以ABCG2作为标志物分离干细胞样细胞,并进一步验证低氧对干细胞特性的影响;　　 3.研究食管鳞癌中Notch1的表达与食管癌患者预后的关系。　　 材料与方法:　　 1.应用低氧培养设备(Xvivo300c)获得精确的培养氧气浓度,在低氧(1%O2)和常氧(20%O2)的条件下培养食管鳞癌细胞KYSE70、KYSE45048小时后,应用MTT实验检测这两个细胞系经不同氧浓度预处理后对细胞生长曲线的影响;通过克隆形成试验观察低氧对细胞的克隆形成能力的影响;应用RT-PCR、westernblot技术,观察不同氧浓度对食管鳞癌细胞KYSE70和KYSE450的低氧诱导因子HIF-1α、HIF-2α和干细胞因子Oct3/4、Sox2、Notch1在mRNA水平和蛋白水平的表达变化;应用流式细胞仪,检测经低氧处理后细胞周期中G0/G1期的变化;　　 2.在1%O2和20%O2的条件下培养食管鳞癌细胞系KYSE70、KYSE45048小时后,首先通过流式细胞技术检测其标志物CD133和ABCG2表达的变化,以确认ABCG2为食管鳞癌干细胞标志物,并以ABCG2为标志物分离这两种细胞,各分成ABCG2bright和ABCG2dim两亚群。通过MTT实验,观察ABCG2bright和ABCG2dim细胞亚群在不同氧浓度下生长曲线的变化;通过克隆形成实验,观察ABCG2bright和ABCG2dim细胞亚群在不同氧浓度下克隆形成能力的区别;通过western blot检测两细胞亚群在不同氧浓度下干细胞因子Oct3/4、Sox2在蛋白水平的表达的变化。　　 3.利用RNA干扰技术,干扰KYSE70细胞的Notch1后,观察其对5-FU化疗敏感性的变化;通过免疫组织化学实验,结合临床资料的分析,找出Notch1的表达与患者临床预后的关系。　　 结果:　　 1.经1%O2处理细胞KYSE70、KYSE45048h后,HIF-1α、HIF-2α、Oct3/4、Sox2在mRNA和蛋白水平的表达相对于20%O2情况下都增高;Notch1在低分化细胞系KYSE70中,在mRNA和蛋白水的表达1%O2都高于20%O2,在高分化细胞系KYSE450中不表达;MTT试验结果显示,KYSE70、KYSE450细胞经低氧预处理48h后,增殖速度显著高于非处理组(P＜0.05);克隆试验结果显示,KYSE70、KYSE450细胞经过1%O2预处理48h后,克隆形成率显著高于非处理组(P＜0.05);细胞周期结果显示:KYSE70、KYSE450细胞经1%02处理后,细胞G0/G1细胞数量著高于非处理组(P＜0.05)。　　 2.流式细胞仪检测KYSE70、KYSE450细胞系中ABCG2和CD133的在1%O2和20%O2的表达,在1%O2的浓度下ABCG2和CD133的曲线均明显右移,由此可见,在低氧的微环境下,ABCG2和CD133的表达同时明显提高。由于CD133已被证实是食管癌干细胞标志物,因此初步判定ABCG2为食管癌干细胞标志物。流式细胞仪筛选出ABCG2brigh和ABCG2dim细胞亚群,Oct3/4、Sox2在ABCG2 brigh曲细胞中的表达高于在ABCG2dim细胞中的表达。低氧诱导后,ABCG2bright细胞中Oct3/4、Sox2表达更高;克隆形成实验显示ABCG2bright细胞克隆形成能力显著高于ABCG2dim(P＜0.05);在低氧预处理48小时后,ABCG2 brigh细胞克隆形成能力更高。　　 3.Notch1对化疗药物的敏感性及与临床预后的关系　　 利用RNA干扰技术干扰KYSE70细胞中Notch1基因,结果显示,干扰48小时,Notch1的表达明显下降,干扰成功。RNA干扰后做5-FU抑制试验,结果显示RNA干扰后抑制率显著增加(P＜0.05),提示Notch1可抵抗化疗作用,Notch1参与肿瘤干细胞的调控。食管鳞癌组织标本的Notch1免疫组化结果显示,156例肿瘤组织中,40例(25.6%)样本表现是阴性,32例(20.5%)是弱阳性,47例(30.1%),是中等阳性,37例(23.7%)是强阳性。在肿瘤组织中,高表达的N0tchl表达与病理学分级(P=0.019)和临床分期(P=0.039)成正相关,但与肿瘤大小(P=0.112)无关明显相关。根据患者10年随访的生存期发现,Notch1的高表达,患者的预后较差,Notch1表达和患者的预后高度负相关(P＜0.05)。　　 结论:　　 1.低氧可提高食管鳞癌细胞KYSE70、KYSE450的干细胞特性。　　 2.ABCG2可以作为肿瘤干细胞标志物分选食管鳞癌细胞系KYSE70、KYSE450细胞中干细胞样细胞。　　 3.Notch1的表达水平与食管鳞癌患者的预后呈负相关。