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二化螟Chilo suppressalis(Walker)是水稻上重要的农业害虫之一,在全世界范围内均有发生。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的杀虫晶体蛋白具有杀虫活性,可通过生物农药和转Bt基因作物的方式应用到有害生物的防治中,研究靶标害虫对Bt蛋白的防御机制非常有必要。MAPK(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路广泛存在于生物体中,在细胞的生长、发育、分化以及凋亡中都发挥着重要的作用。ERK基因在MAPK信号通路中发挥着重要作用。本研究通过RNAi技术研究CsERK在二化螟防御Cry1Ca蛋白过程中的作用,主要研究结果如下: 1.利用RT-PCR结合RACE技术克隆二化螟ERK基因并获得cDNA序列全长。CsERK1基因序列全长1,892bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列为1,209bp,编码403个氨基酸,预测蛋白的分子量为44.51kDa;CsERK2基因序列全长2,015bp,ORF序列为1,092bp,编码364个氨基酸,预测蛋白的分子量为41.96kDa。结果显示,两个序列的内同源性较低,仅为21.5%。 2.利用实时荧光定量PCR技术,分析CsERK基因在二化螟不同龄期及不同组织内的时空表达模式。时间表达模式结果显示,CsERK1基因在蛹和成虫中表达量最高;CsERK2基因在成虫中表达量高于其他龄期;空间表达模式结果显示,两个CsERK基因均在中肠的表达量最高。 3.将不同浓度的Cry1Ca蛋白混入饲料饲喂二化螟三龄幼虫,并通过实时荧光定量PCR技术检测二化螟ERK基因的表达情况。结果显示,二化螟三龄幼虫在取食20μg/g的Cry1Ca人工饲料30min后,CsERK1基因表达量迅速上调为对照组的3倍,CsERK2基因表达量无显著变化;取食60μg/g的Cry1Ca人工饲料30min后,CsERK1基因表达量无显著变化,CsERK2基因表达量显著下调,1h后出现小幅上调。 4.通过饲喂法对二化螟初孵幼虫ERK基因进行沉默,48h后取样检测沉默效率,结果显示CsERK1、CsERK2基因沉默效率分别为46.2%、38.5%。干扰48h后,将幼虫转至含30μg/g的Cry1Ca蛋白的人工饲料或表达Cry1Ca蛋白的转基因水稻胚芽中饲喂7d。生测结果显示,两个处理组与对照组相比,幼虫死亡率均无显著差异。说明Cry1Ca蛋白虽然可以引起ERK基因表达量的变化,但沉默二化螟ERK基因对幼虫死亡率没有影响,这预示着ERK基因不参与二化螟对Cry1Ca蛋白的防御机制。