腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是治疗终末期肾衰竭患者的主要替代治疗方式之一。与血液透析(hemodialysis，HD)相比，PD作为终末期肾脏病一体化治疗的初始选择有很多优点，包括费用相对较低、能延缓残余肾功能下降速度、较好的清除中分子物质、有较佳的血流动力学稳定性、对生活方式的影响较小等。然而，在长期腹膜透析过程中，腹膜与非生理性的含糖腹透液持续接触，以及反复发生的腹膜炎等因素最终可导致腹膜纤维化(Peritoeneal Fibrosis，PF)的发生，临床上出现超滤失败。这是患者退出腹膜透析的主要原因之一，同时也制约了腹膜透析的应用和发展。 目前，腹膜纤维化发生的具体机制仍不十分清楚，防治的措施也十分有限，因此探讨腹膜纤维化的发病机制，并寻求有效的防治方法，具有重要的临床意义。 许多研究表明，转化生长因子β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)在腹膜间皮细胞转分化过程中起到关键的作用，参与了腹膜纤维化的启动和进展。而TGF-β1主要是通过Smad信号蛋白来实现信号的胞内传递。已有许多文献报道Smad信号蛋白在各器官的纤维化中发挥着重要的作用，如肾、肝、肺、心等。 除了Smad通路之外，JNK(c-Jun氨基末端激酶)通路可能也参与了TGF-β1诱导的EMT过程。JNK又称为应激活化蛋白激酶(stress-activated MAPkinases，SAPK)，属于MAPK(mitogen-activated protein kinase)中的一种。多种刺激信号如细胞因子、生长因子和环境应激等可以介导JNK的活化。许多研究表明JNK信号通路在多种生命过程中起重要作用，如细胞分化、细胞凋亡、应激和基因表达等。有研究认为，在TGF-β1诱导的基因转录过程中，JNK和Smad信号之间存在相互作用。且体内及体外实验均证实TGF-β1和其他细胞因子能够诱导JNK对Smad2/3的磷酸化。然而，在大鼠腹膜间皮细胞(rat peritoneal mesothelial cells，RPMCs)，JNK能否被TGF-β1激活，JNK是否在TGF-β1诱导EMT中发挥一定的作用，以及JNK对Smad信号通路有何影响，两者之间是否存在交叉对话等，目前仍不清楚。 本研究的目的是探讨JNK在TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用，及JNK与Smad信号蛋白之间的相互作用，进而探讨腹膜间皮细胞转分化的分子机制，为临床防治腹膜纤维化提供实验依据。本研究的主要内容包括： 1.TGF-β1对大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响。 2.TGF-β1对大鼠腹膜问皮细胞JNK、Smad2及Smad3磷酸化的影响。 3.JNK特异性抑制剂对TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞JNK、Smad2及Smad3磷酸化的影响。 4.JNK特异性抑制剂对TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响。 5.TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中JNK与Smad3之间的相互作用。 目的：观察JNK特异性抑制剂(SP600125)对TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响方法：采用腹腔注射胰蛋白酶法，分离培养RPMCs，常规传代、鉴定，取第二代腹腔间皮细胞用于实验研究。应用JNK特异性抑制剂(SP600125，10uM)预处理细胞4h后，加入TGF-β1(10ng/ml)刺激24h、48h收集细胞。将RPMCs分成四组：A：无血清对照组；B：TGF-β1(10ng/ml)刺激组；C-TGF-β1(10ng/ml)+SP600125(10uM)组；D：SP600125(10uM)组。RT-PCR检测α-SMA、E-cadherin、CollagenI、MMP2 mRNA表达，Western blotting检测α-SMA、E-cadherin、Collagen1、MMP2蛋白表达，间接免疫荧光检测α-SMA、E-cadherin、Collagen I蛋白在细胞内的表达和分布。结果：TGF-β1刺激组与对照组比较，α-SMA、Collagen I、MMP2 mRNA和蛋白表达明显上调，E-cadherin mRNA和蛋白表达明显下调(P均<0.05)，加入SP600125能明显抑制TGF-β1诱导的α-SMA、Collagen I、MMP2 mRNA和蛋白的高表达，对E-cadherin mRNA和蛋白的下调表达也具有抑制作用(P均<0.05)；与对照组比较，单纯加入SP600125对细胞各指标的表达无明显影响；间接免疫荧光结果表明，TGF-β1刺激RPMCs 48h，胞内α-SMA、Collagen I表达明显增多，E-cadherin表达明显减少，SP600125对上述指标表达水平的变化有明显的抑制作用。 小结：JNK特异性抑制剂可以显著抑制TGF-β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化(EMT)。 目的：观察TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中JNK与Smad3之间的交叉对话。 方法：利用PCR定点突变法构建Smad3C末端磷酸化位点突变质粒(Smad3M)，并测序鉴定。采用腹腔注射胰蛋白酶法，分离培养RPMCs，常规传代、鉴定，取第二代腹腔间皮细胞用于实验研究。TGF-β1(10ng/ml)经不同时间(0 min、5min、10min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h、48h)刺激RPMCs后收集细胞。应用Lipofectmine2000将pcDNA3空载体质粒、pcDNA3-Smad3M重组质粒或pEGFP-C1质粒分别瞬时转染RPMCs。转染Smad3突变质粒(1ug/ml)时，细胞分组如下：A:pcDNA3空载体转染组；B：pcDNA3空载体转染+TGF-β1(10ng/ml)组；C：pcDNA3-Smad3M转染组；D：pcDNA3-Smad3M转染+TGF-β1(10ng/ml)组。应用人胚肾293细胞作为包装细胞，扩增携带有Dominant-Negative JNK1基因的重组腺病毒(Ad-DN-JNK1)，并用CsCL超速离心法对其进行纯化，纯化后用Ad-DN-JNK1感染RPMCs。分组如下：A：无血清对照组；B：Ad-DN-JNK1感染组；C：TGF-β1(10ng/ml)+腺病毒空载体组；D：TGF-β1(10ng/mL)+Ad-DN-JNK1感染组。Western blotting 检测p-JNK、p-Smad2和P-Smad3蛋白表达水平。结果：基因测序结果显示Smad3C末端磷酸化位点缺失，Smad3突变质粒(Smad3M)构建成功。Smad3M按不同浓度(0、0.5、0.75、1、2 μg/ml)转染RPMCs，Smad3M蛋白表达逐渐增高，浓度为1 μg/ml时最明显。TGF-β1刺激RPMCs 0～48h，JNK出现两个活化高峰，第一个高峰在10min(与第二章相同)，第二个高峰出现在12h。转染Smad3M质粒后，不能抑制TGF-β1诱导的JNK10min活化，但可以抑制TGF-β1诱导的JNK 12h活化。细胞感染Ad-DN-JNK1后，可以抑制Smad3的磷酸化活化(与JNK特异性抑制剂效果相似)。 小结：1.通过转染Smad3M质粒不能抑制TGF-β1诱导的JNK第一个活化高峰(10min)，但可以抑制TGF-β1诱导的第二个活化高峰(12h)；2.RPMCs感染Ad-DN-JNK1后，可以抑制Smad3的磷酸化活化。表明JNK与Smad3之间存在相互激活作用：TGF-β1刺激RPMCs后首先诱导JNK迅速活化(5～10min)，结果促进了Smad3的磷酸化活化(30min)，活化的Smad3又可以促进JNK出现第二次激活(8～16h)。 1.TGF-β1能够诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化(EMT)。 2.TGF-β1刺激大鼠腹膜间皮细胞导致JNK、Smad2及Smad3磷酸化活化，JNK的活化高峰早于Smad2和Smad3。 3.JNK特异性抑制剂(SP600125)对TGF-β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞p-Smad3高表达有抑制作用，但对p-Smad2高表达无明显影响。 4.JNK特异性抑制剂(SP600125)可以抑制TGF-β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化(EMT)。 5.在TGF-β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化过程中JNK与Smad3之间存在相互激活作用。