产毒多杀性巴氏杆菌(toxigenicPasteurellamultocida，T+Pm)是猪进行性萎缩性鼻炎(Swineprogressiveatrophicrhinitis，PAR)的主要病原菌。该菌分泌产生的多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurellamultocidatoxin，PMT)是一种约146kDa的皮肤坏死毒素。该毒素由toxA基因编码，是T+pm的主要致病因子。PMT有很强的致病性，只注射少量提纯的PMT就可以复制PAR。鉴于PMT在PAR的产生过程中所起的重要作用，有关PMT的检测便成为检测PAR的关键。PMT的N端是粘附位点，C端是催化位点，中间区域为跨膜区，虽然PMT具有很强的致病性，但是部分缺失的PMT蛋白可以失去其致病性而保留免疫原性，这对于PAR疫苗的研制具有重要的意义。 本研究针对T+Pm的toxA基因及其表达产物开展了以下工作： 1、参照GenBank已发表的toxA基因序列，分别设计了针对T+PmtoxA基因及其3`端的2对寡核苷酸引物。以本实验室分离保存的T+Pm菌株HN-13为实验材料，用PCR的方法成功扩增toxA基因的全序列及其3`端基因片段C2115。对toxA基因的PCR产物进行序列测定，结果表明：该片段共4019bp，ORF为3858bp(登陆号：AY864768)；与GenBank上所报道的toxA基因序列核苷酸同源性都在99.8％以上。将扩增的基因插入原核表达载体pGEX-KG，成功构建了重组质粒pGEX-toxA。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经诱导获得大小约173kDa的表达蛋白(rPMT)。Westernblot检测表明，表达蛋白具有良好的反应原性。动物试验表明，以表达蛋白免疫的昆明小鼠，可以抵抗天然毒素致死剂量的攻击。 2、为了更好的研究毒素蛋白的生物学活性，在所克隆的toxA基因的基础上，用酶切的方法获得了5个亚克隆片段：N1518、N3172、C2345、C2693和C3388。将上述5个基因片段和3’端基因片段C2115插入pET-28a(b，c)载体系统，分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。结果pET28b-C2115和pET28a-N1518重组质粒获得了高效表达，分别表达了toxA5’端的1518个碱基和3’端基因的2115个碱基。表达蛋白的大小分别约57kDa(rPMT-N)和78kDa(rPMT-C)，Westernblot检测表明，两种表达蛋白具有良好的反应原性。 3、分别以rPMT-N和rPMT-C免疫大白兔，连续免疫5次，每次间隔10d，并用琼脂双向扩散试验检测效价。结果，rPMT-N抗血清效价达1/32，rPMT-C抗血清效价达1/16。 4、以rPMT-N和rPMT-C的混合物为抗原，初步建立一种检测PMT抗体的间接ELISA方法。经方阵滴定确定抗原最佳包被浓度为1.6μg/mL、血清最佳稀释倍数为1：40，阴阳性界限为OD630=0.291；用该方法检测608份临床送检血清，结果表明阳性率达69.6％。 5、以rPMT、rPMT-N、rPMT-C、及rPMT-N和rPMT-C的混合物分别与灭活的T+Pm(3.3×108个/mL)和支气管败血波氏杆菌(5×108个/mL)辅以白油乳化制成类毒素菌苗，并以该疫苗免疫本动物试验。检测结果初步显示，rPMT-N和rPMT可以用于制备PAR疫苗。 6、以我们实验室保存的T+Pm菌株HN-13为材料，绘制细菌生长曲线。结果表明，接种后3h进入对数生长期；7h时进入稳定期；并于15h时逐渐转入衰亡期。 本研究是国内首次成功克隆并表达了T+Pm菌株HN-13毒素toxA全基因及其两端亚克隆基因，为研制猪进行性萎缩性鼻炎新型基因工程疫苗奠定了基础；并将表达产物作为抗原初步建立一种检测PMT抗体的间接ELISA方法，为PAR的检测方法提供了新的思路。