CAR-T（Chimeric antigen receptor T）细胞疗法作为目前最有前景的肿瘤免疫疗法之一,在恶性血液肿瘤细胞过继免疫治疗中表现出显著抗肿瘤疗效和良好临床缓解率。但就目前CAR-T细胞治疗仍存在较多的挑战,单一的CAR-T细胞免疫疗法在治疗实体肿瘤时存在效果不佳、生存时间不长的问题,在血液瘤治疗中仍存在较高复发机率和产生耐药性的可能;慢病毒载体的短缺已经成为其应用于细胞免疫治疗行业的瓶颈。探索符合c GMP（Current good manufacture practices）级别规模化和可重复的慢病毒生产工艺,成为临床细胞治疗中关键的环节;且目前市面上可用于直接临床注射的CAR-T细胞冻存液相对较少,临床级的细胞冻存液的研发也成为了CAR-T细胞治疗必不可少的环节。随着细胞免疫疗法研究的发展,越来越多联合疗法得到应用。然而,关于最具潜力的治疗靶点CD30联合免疫检查点PD-1敲降技术抗肿瘤效果的研究还未见报道。实验选择CD30作为治疗靶点,联合PD-1敲降技术并研究其对霍奇金淋巴瘤临床前联合效果,为临床治疗提供理论依据。实验首先研究CAR-T细胞制备工艺中anti-CD3/CD28磁珠和慢病毒对T细胞中PD-1蛋白表达的影响。实验结果显示,在Jurkat细胞系中加入anti-CD3/CD28磁珠和CAR-CD30慢病毒能够显著刺激PD-1蛋白表达,分别为63.5±4.9%（P＜0.01）和63.0±5.3%（P＜0.01）的。添加0.5:1抗CD3/CD28磁珠对Jurkat中PD-1表达的刺激48 h内呈量效关系,之后随时间增加PD-1蛋白表达下降,144 h时下降到4.5±0.3%以内。CAR-CD30慢病毒以MOI=3感染复数刺激Jurkat细胞后,载体携带CAR-CD30抗体与细胞系CD30抗原蛋白反复结合,持续上调PD-1,致使转染阳性细胞过度刺激,其阳性细胞比例随时间增加而减少。0.5:1比例添加的anti-CD3/CD28磁珠能短暂性提高T细胞中PD-1蛋白3倍左右的表达,且不影响T细胞活率。CD30蛋白在正常人T细胞中表达相对较低,实验证实在CAR-CD30慢病毒刺激T细胞没有呈现显著的PD-1上调（P＞0.05）。肿瘤患者微环境复杂,周边细胞携带抗原蛋白可能刺激T细胞PD-1的表达。实验同时进一步强调CAR-T细胞联合免疫检查点PD-1治疗药物的有效性。本研究体外筛选出一条敲降50%左右PD-1表达的序列。通过慢病毒载体携带PD-1干扰RNA方式联合CAR-CD30蛋白的方法在体外治疗霍奇金淋巴瘤。实验结果表明PD-1敲低和CAR-CD30蛋白的增加,都会显著抑制T细胞增殖（P＜0.01）,且CAR-CD30蛋白的影响更为显著。同时实验证实CAR-CD30-T细胞对L428具有一定的靶向杀伤性,而PD-1的敲低在一定程度上抑制其杀伤效果。因此,实验表明PD-1干扰RNA可能不适合与CAR-CD30细胞治疗联合抗肿瘤。同时本研究采用L型大泡通气系统的机械式搅拌生物反应器培养293悬浮细胞进行规模化包装慢病毒载体。实验首先应用4种方法驯化293T细胞,并对其慢病毒包装能力进行验证。随后建立种子扩增链,并在5.5 L的工作体积生物反应器中绘制悬浮细胞生长曲线和包装慢病毒载体。实验表明,采用293CD05Medium无血清基础培养基和SMM293-TⅡ培养基体积一比一混合培养可以快速驯化293T细胞,成功得到野生型且具有慢病毒包装能力的悬浮细胞系。悬浮细胞在机械式搅拌生物反应器中培养,两天后细胞密度可达1.5×10~6cells/m L。添加质粒复合物和补料培养基,共经四天的培养可以收获6.5×10~7TU/m L滴度的慢病毒粗产品。机械式搅拌生物反应器慢病毒包装工艺与细胞工厂工艺相比,成本低、效率高,具有很强的竞争力。为了得到足够数量的活性CAR-T细胞,实验研发出一种临床级可注射的CAR-T细胞冻存液。实验研究冻存液稳定性,优化最佳冻存配方,摸索CAR-T细胞复苏后回输时间,检测了冻存液渗透压和p H及冻存前后细胞CAR的表达和体内外对肿瘤细胞的杀瘤作用。实验结果证实按不同比例原料配制成冻存液在安瓿中4℃放置60天化学性质依然稳定。采用最佳冻存溶液配方（7.5%DMSO、30%转化糖和电解质注射液、4%葡聚糖40葡萄糖注射液、10%HES和电解质注射液、1%Vc和30%HSA）,CAR-T细胞凋亡率仅为2%,效果好于目前商业冻存溶液。冻存液的渗透压为1922m Osm/kg,p H为6.4。为了减少高渗透压带来的危害,稀释40倍后渗透压为311m Osm/kg,满足注射的要求。实验表明在1-1.5 h内CAR-T细胞恢复了对RAJI杀伤的特性,并且复苏CAR-T细胞在体内外也具有有效的抗肿瘤活性。冻存液在理论上还能够静脉回输,因此具有良好的推广前景。