论文部分内容阅读
细胞色素P450(Cytochrome P450)酶系的诱导已被认为是反映环境污染状况最灵敏的生物学反应之一,其中CYP1A (Cytochrome P4501A)对污染物响应敏感,可作为生物标志物反映水体受原油等有机污染物污染的情况。因此,建立一种快速简便的方法检测ICYP1A对环境监测具有重要意义。环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新型的核酸扩增技术,因具有灵敏度高、特异性强、简便、快速等优点目前已广泛应用于细菌、寄生虫、病毒等方面的定性检测。本研究建立并优化褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)肝CYPIA的LAMP技术,与real-time PCR技术进行比对,验证LAMP技术应用于CYPIA定量的可行性；利用LAMP定量技术测定石油水溶性成分(Water soluble fraction, WSF). Cd和Pb单独污染后褐菖鲉肝CYP1A mRNA表达量,分析褐菖鲉肝CYPIA基因对石油WSF及Cd、Pb单独污染的响应；用石油WSF和重金属对褐菖鲉进行复合污染实验,检测褐菖鲉肝CYP1A mRNA表达量,分析褐菖鲉肝CYP1A对WSF及Cd和Pb复合污染的响应。主要研究结果如下：(1)建立并优化了褐菖鲉肝CYP1A的LAMP检测技术,优化后的LAMP体系外引物与内引物浓度比为1：6,Mg2+浓度为6.0mmol·L-1,甜菜碱浓度为0.4mol·L-1, dNTP浓度为1.4mmol·L-1,在64℃反应50min。(2)分析两种方法测定的石油WSF污染后褐菖鲉肝脏CYPIA表达量,发现LAMP与real-time PCR检测结果有高度的一致性,证实了LAMP技术应用于海洋鱼类基因定量的可行性。(3)利用定量LAMP技术检测石油WSF. Cd和Pb单独污染后褐菖鲉肝CYP1A mRNA表达量,结果表明褐菖鲉肝CYP1A对石油WSF和Pb污染响应敏感,而对Cd污染没有明显的响应。石油WSF单独暴露后,褐菖鲉肝CYP1A表达量呈现先上升后下降的趋势。CYPIA mRNA表达量首先随着WSF浓度的升高而增加,在50μg·L-1时CYP1A mRNA表达量达到最大值,而后CYPIA mRNA表达量开始呈现下降趋势,但是仍然被显著诱导。Cd暴露后,褐菖鲉肝CYP1A表达量无明显变化,而Pb暴露后,CYP1A mRNA表达被显著诱导。(4)利用定量LAMP技术检测石油WSF和Cd、Pb复合污染后褐菖鲉肝CYP1A mRNA表达量。结果表明褐菖鲉肝CYP1A对Cd和WSF复合污染响应不够敏感；而褐菖鱼由肝CYP1A对Pb和WSF复合污染响应非常敏感,且Pb促进WSF对CYP1A mRNA的诱导。