疟疾是世界上最常见和最严重的热带疾病之一,世界上百分之四十人口随时面临着感染疟疾的危险,世界各地每年至少发生3亿疟疾感染病例,至少导致100万人死亡,其中大多数发生在医疗卫生资源最匮乏的国家。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum , Pf)是引起撒哈拉以南非洲地区疟疾感染的主要病原体,能够引起重症疟疾甚至导致死亡,而幼童和孕妇的疟疾感染率和死亡率最高。许多儿童在出生头两年初次感染疟疾,因为免疫系统尚未发育完全,无法产生足够强的免疫力,因此这个年龄段感染了疟疾的预后特别差。在世界范围内,疟疾是儿童死亡的主要病因,几乎每30秒就有一名儿童死于疟疾。近年来,由于疟原虫抗药性虫株及抗杀虫剂蚊媒的产生和扩散,还有对抗疟药物的不当使用等,使得疫区防治形势十分严峻,迫切需要寻找新型有效的方法用于疟疾防治。所以,研制安全、有效,特别是能够用于儿童疟疾预防的疫苗已经成为当务之急。尽管疟原虫的生物学研究中尚有许多未知领域,但疟疾疫苗的研究在最近30年中仍取得了良好的进展。以疟原虫的生活史各个时期的主要保护性抗原为靶抗原,科研人员已着手研发了一系列候选的疟疾疫苗,并推向临床试验,如CSP疟疾疫苗、MSP1疟疾疫苗、pfs25疟疾疫苗和多期多价的SPf66合成肽疟疾疫苗等。其中也包括本教研室主研的红内期重组疟疾疫苗PfCP-2.9。该疫苗由恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(Merozoite Surface Protein 1,MSP1)和裂殖子顶端膜抗原1(Apical Membrane Antigen 1,AMA1)的C-末端区域通过连接序列P28融合而成,并在毕氏酵母中得到高水平分泌表达。以Montanide ISA720为佐剂,能够诱导新西兰白兔及恒河猴产生高水平的抗体滴度,15%的PfCP-2.9免疫血清能有效抑制疟原虫生长。本研究对PfCP-2.9疫苗免疫志愿者和现场感染者体内的抗体特异性进行分析,并利用本实验室人类白细胞分化抗原(Human Lymphocyte Antigen,HLA)相关资料分析HLA类型与志愿者抗体免疫应答水平的内在关联性;利用本实验室PfCP-2.9单克隆抗体对志愿者血清中产生的抗体类型进行分析;另外,亲和纯化针对PfCP-2.9及其各组分抗原的特异性抗体进行体外抑制实验,来分析特异性抗体对恶性疟原虫体外生长的抑制作用。PfCP-2.9重组疟疾疫苗由MSP1 C末端19kDa片段(MSP1-19)及AMA1的第III亚区(AMA1-III)通过连接序列P28融合而成,其中MSP1-19包含两个表皮生长因子样结构域(Epidermal Growth Factor-like domain,EGF-like domain),分别命名为EGF1和EGF2。为了探讨PfCP-2.9疫苗免疫志愿者产生免疫应答反应的特异性及产生疟疾免疫保护作用的区域,本实验室已构建和表达了MSP1-19和AMA1(III)两个重组蛋白和P28合成肽,以及MSP1-19的两个EGF样结构域即EGF1和EGF2。为了解PfCP-2.9重组疫苗的免疫原性,以PfCP-2.9及其组分MSP1-19、AMA1(III)为包被抗原,选取68份PfCP-2.9疫苗的临床试验志愿者免疫血清(其中48份为免疫组,20份为安慰剂组),利用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的方法检测各组分抗原在志愿者体内产生的特异性抗体的水平。结果显示,除了20名安慰剂组志愿者外,其余48名志愿者均能产生针对PfCP-2.9、MSP1-19、AMA1(III)的特异性抗体。比较这48名免疫组志愿者免疫血清中针对各组分抗原的抗体效价发现,以抗PfCP-2.9抗体为最高,平均为13,931,最高的志愿者达106以上。68名志愿者分别来自三个免疫剂量组(5ug,20ug,50ug),经过对各组抗体效价均数的统计分析,50ug组明显高于5ug组和20ug组,存在显著差异(P<0.01)。所有志愿者血清均能识别组分抗原MSP1-19和AMA1(III),但其抗体效价远低于抗融合抗原PfCP-2.9的,前两者相比,以MSP1-19抗体效价较高,约为AMA1(III)的三倍,平均效价为5,534,效价最高的志愿者可达5×104万以上。根据第二次免疫时间的差异,将68名志愿者分为A、B两组,A组第二次免疫时间为第一次免疫后60天,B组第二次免疫时间为第一次免疫后90天,两组第三次免疫时间均为第一次免疫后180天。将两组(相同剂量)中针对各组分抗原的抗体效价平均数进行统计分析表明,两组之间的抗体水平无明显差异(P﹥0.05)。大部分免疫组志愿者血清中针对PfCP-2.9特异性抗体水平远高于相应的针对MSP1-19以及AMA1(III)的抗体效价之和,提示融合抗原较两个组分具有更强的免疫原性。通过ElISA实验和统计分析HLA-DRB1基因类型与PfCP-2.9抗体免疫应答水平的关联性发现,HLA-DR6可能抑制了PfCP-2.9免疫志愿者抗体免疫应答。为了解PfCP-2.9重组疫苗免疫志愿者血清对天然虫体的识别能力,用本实验室培养的恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)进行间接荧光抗体实验(IFA),结果发现重组疫苗免疫志愿者血清能识别天然虫体;通过裂解恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)虫体,抽提其膜蛋白进行Western-Blot试验,结果发现重组疫苗免疫志愿者血清能识别MSP-1和AMA1的条带。提示PfCP-2.9重组蛋白与天然构象十分接近。在以上实验的基础上,我们进一步分析了志愿者免疫血清的抗体类型,结果表明,IgG1是免疫血清中的主要抗体类型。免疫血清中也同时能检测到IgG3和IgG4,但没有检测到IgG2亚类。在各剂量组上,20ug组和50ug组在IgG1、IgG3水平上明显高于5ug组,50ug组在IgG4水平上明显高于5ug和20ug组。此外,我们还对临床志愿者血清与疟疾流行区患者血清中特异性抗体进行了对比分析,结果表明,在志愿者体内产生了比疫区患者更高的针对PfCP-2.9、MSP1-19以及AMAI(III)的抗体。在疟疾流行区患者中,多次感染者血清针对PfCP-2.9、MSP1-19以及AMAI(III)的抗体效价明显高于初次感染者,除在针对AMAI(III)效价两者之间差异不显著,P值为0.062,﹥0.05外,两者之间针对PfCP-2.9和MSP1-19的抗体效价均有显著差异,分别为P<0.01和P<0.05。成人感染者针对PfCP-2.9、MSP1-19以及AMA-I(III)的抗体效价均高于儿童感染者,但未发现显著差异。在疫区反复感染者体内产生的主要IgG亚类是IgG1,其次是IgG3,仅有少量的IgG4,没有检测到IgG2.为探讨志愿者免疫血清中是否产生了与小鼠,新西兰兔识别相同表位的抗体,我们使用本室制备的14株抗PfCP-2.9单克隆抗体,与志愿者的免疫血清在同一条件下与PfCP-2.9蛋白进行竞争性ELISA实验,结果有9株单抗与志愿者免疫血清发生竞争反应,提示志愿者体内可能产生了与单克隆抗体识别相同表位的抗体。在这些单抗中,有5株有不同程度的体外抑制疟原虫体外生长的抑制率,提示在志愿者血清中能够产生抑制性抗体。在兔免疫血清、鼠免疫血清与PfCP-2.9单克隆抗体竞争性ELISA实验中,兔免疫免疫血清与全部14株单抗发生竞争反应且大部分产生较强竞争,提示兔免疫血清中特异性抗体能识别更多PfCP-2.9的抗原表位;本研究进一步对免疫志愿者血清、兔免疫血清、鼠免疫血清进行竞争性ELISA实验,结果表明,兔免疫血清和鼠免疫血清产生的抗体均比免疫志愿者免疫血清识别更多PfCP-2.9的抗原表位。为进一步了解免疫志愿者血清与疟疾流行区感染者PfCP-2.9特异性抗体对恶性疟原虫体外生长的影响,我们纯化了针对PfCP-2.9及其组分MSP1-19、AMA1(III)、EGF1、EGF2的特异性抗体进行体外疟原虫生长抑制实验,结果显示,除志愿者EGF2特异抗体无作用外,其余各组抗体均产生不同程度的体外抑制原虫生长效力,在相同抗体浓度下,疟疾流行区感染者特异性抗体的体外抑制效果略高于免疫志愿者。在各组分抗原的特异性抗体中,MSP1-19特异性抗体的体外抑制效果高于其他各组分,提示疟疾免疫保护性区域可能主要在MSP1-19部分。本研究结果表明,红内期重组疟疾疫苗PfCP-2.9在人体内具有很强的免疫原性,且抗体水平与剂量有一定关系。融合后的抗原产生的抗体水平明显高于各组分抗原。IFA与Western-Blot表明,PfCP-2.9重组蛋白十分接近天然构象。抗体亚类分析显示,IgG1是主要的抗体类型,IgG4可能是导致50μg组效价高于其他组的主要成分。通过PfCP-2.9免疫,能够在志愿者体内产生比疫区患者更高的抗体水平。此外通过竞争性ELISA的方法以检测志愿者免疫血清中抗体类型产生的情况,比较与动物免疫、自然免疫的差别,以预测重组PfCP-2.9疟疾疫苗的免疫保护作用。体外抑制实验结果提示,志愿者体内的特异性抗体并没有起到与动物免疫血清相类似的有效抑制原虫生长的作用,一方面可能由于动物免疫与人类免疫机制的差异,另一方面可能由于动物免疫抗体效价远远高于免疫志愿者的且抗体识别表位也远多于免疫志愿者的。这种免疫差异的机制还有待进一步研究。