论文部分内容阅读
凋亡即细胞的程序性死亡,其调节机制的紊乱将导致肿瘤的发生。Survivin是新近发现的一种凋亡抑制基因,其表达的蛋白是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的新成员。与其它IAP家族成员不同的是,Survivin具有独特的结构,只有一个杆状病毒IAP重复序列(baculovirus IAP repeat,BIR),而无羧基末端的环指结构。其表达于多种常见肿瘤细胞中,而不表达或低表达于正常成人组织。Survivin通过直接抑制Caspase-3、Caspase-7,或干扰Caspase-9的活性,从而阻断线粒体途径和死亡受体途径两条主要凋亡途径的最后通路;还可通过有丝分裂纺锤体的微管调节细胞周期的G2/M期。在Survivin表达阳性的肿瘤中,其平均凋亡指数(apoptosis index,AI)显著低于Survivin表达阴性的肿瘤,因而认为Survivin具有抑制凋亡和促进细胞增殖的作用。随着对Survivin基因研究的深入,Survivin将成为肿瘤诊断及治疗的新靶点。 卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最常见的致死原因,患者5年存活率仅为40.9%,严重威胁着妇女的健康。目前,随着分子生物学的迅速发展,普遍认为肿瘤的发生发展与肿瘤细胞的生物学改变密切相关。然而,对卵巢癌恶性行为导致的细胞及分子改变研究不多。研究表明,Survivin在多种肿瘤中的表达均与其恶性行为的增加和患者存活率减少有关。有关卵巢癌和卵巢良性肿瘤中Survivin的定性、定量检测及其与临床病理因素关系的研究甚少。本文通过检测卵巢良、恶性肿瘤中Survivin蛋白及其mRNA的表达,评估了其与细胞增殖活性之间的关系及其临床意义。此外,Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的体内、外研究尚未见报道。 反义技术是否可通过抑制Survivin表达而促进肿瘤细胞死亡尚不清楚。本研究探索了Survivin反义核酸对人卵巢癌细胞系的生长抑制作用及其反义核酸转染对人卵巢癌细胞在裸鼠皮下成瘤能力的抑制作用。了解DDP、TPT单独及联合应用对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的郑州大学2004届博士毕业论文Survivin在卵巢癌中的表达及其反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究抑制作用,并且研究DDP及TPT对’卵巢癌裸鼠移植瘤中Survivin表达的影响,进一步探讨化疗药物与肿瘤组织中抗凋亡基因Survivin表达两者的相关性。方法 1.分别采用免疫组化和原位杂交方法对38例卵巢癌组织、12例卵巢良性肿瘤组织中SurVlvin蛋白、PCNA蛋白及SurvivinlnRNA表达进行检测。并进一步通过免疫组化、免疫荧光和RT一PCR检测了卵巢癌细胞系SK0v3、SW626中Survivin蛋白及mRNA的表达。 2.应用基因重组技术,将在真核细胞中能稳定表达反义Survivin的peDNA3一swas经脂质体LIPofectamineTM2000介导转染人卵巢癌细胞株sKov3细胞,经G418筛选得到抗性克隆,同时以空质粒PcDNA3转染sKoV3作为对照。四甲基偶氮哇蓝光吸收法(MTT法)检测细胞活性并绘制细胞生长曲线,研究细胞(4xl护/孔)的生长和增殖情况,观察反义Survivin对SKOV3细胞的生长抑制作用。 3.分别采用免疫组化、RT一PCR检测反义Survivin对SKOV3细胞系内源性Survivin蛋白及mRNA表达的抑制作用,流式细胞法检测其对细胞凋亡的影响。 4.选用裸鼠24只,随机分为3组。于裸鼠背部分别接种人卵巢癌SKOV3细胞、SKOV3/nco细胞和SKOV3/S VVas细胞。观察裸鼠皮下种植瘤成瘤情况,自皮下接种后第6d起,每3d用游标卡尺测量瘤体最长径(a)与最短径伪),观察肿瘤体积变化,并计算抑瘤率。 5.采用MTT法检测转染细胞对化疗药物拓扑替康(T PT)的敏感性。SKOv3细胞凋亡的DNA凝胶电泳和末端脱氧核酞转移酶介导的脱氧尿昔三磷酸标记法 (TUNEL)检测化疗药物TPT对细胞凋亡的影响。 6.采用免疫组化、免疫荧光和RT一PCR检测不同浓度TPT对卵巢癌SKOV3细胞系中Survivin蛋白及mRNA表达的影响。 7.在24只裸鼠背部皮下接种人卵巢癌SKOV3细胞,Zld后分为4组,分别给予生理盐水、顺铂(DDP)、TPT、DDP+TPT腹腔注射。于治疗第18d处死裸鼠。治疗期间观察并记录各组裸鼠皮下移植瘤的生长情况,计算肿瘤体积,鼠重变化,肿瘤生长抑制率,绘制肿瘤生长曲线。采用免疫组化、RT一PCR检测化疗药物治疗后裸鼠肿瘤组织中Survivin蛋白及mRNA的表达情况。 8.统计学处理:所有数据均经统计软件sPssl 1 .0统计分析。采用了检验、秩郑州大学2004届博士毕业论文survlvin在卵巢癌中的表达及其反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究和检验、t检验、单因素方差分析及F检验。以P<0.05为差异有显著性,P<0.ol为差异有高度显著性。结果 1.卵巢癌组织免疫组化、原位杂交结果显示,在良、恶性卵巢肿瘤中,Survivin蛋白阳性表达率分别为33.33%、81.58%,两者之间差异具有显著性沪<0.01)。SurvivinmRNA阳性表达率分别为25.00%、68.42%,两者之间差异具有显著性(介0.025)。survivin蛋白表达阴性的卵巢癌组织中PCNA的标记指数为(25.71士9.76)%,31例Survivin蛋白表达阳性的卵巢癌组织中PCNA的标记指数为(69.0肚16.25)%,两者差异有显著性(P<0.001)。Survivin蛋白、Survivin mRNA表达均与临床病理分期、组织学分级、淋巴结转移?