卵丘细胞是围绕在卵母细胞周围的一类功能特化的颗粒细胞,在卵母细胞成熟过程中起重要的作用。卵丘细胞通过缝隙连接或形成细胞突起的方式给卵母细胞提供各种营养物质,如丙酮酸、氨基酸和生长因子等,并通过传递环化腺苷酸(c AMP)和环化鸟苷酸(c GMP)等调节卵母细胞减数分裂。卵丘细胞与卵母细胞之间的紧密联系提示卵丘细胞可能作为反应卵母细胞发育潜能的一个重要非侵入性生物标志物。卵母细胞体外成熟技术(IVM)是通过体外培养获得成熟卵母细胞的一项技术,但目前IVM面临着获得的卵母细胞成熟率低,卵母细胞发育潜能差等诸多挑战。如何改善IVM后卵母细胞质量,并对优质卵母细胞进行挑选是目前临床面临的急需解决的难题。此外,由于体外培养的特殊环境常使卵母细胞面临着氧化应激压力,而卵丘细胞可以通过传递谷胱甘肽有益于卵母细胞的抗氧化作用。我们课题组在前期的实验中比较了不同发育潜能的卵母细胞所对应的卵丘细胞的转录组差异,并比较了体内成熟与体外IVM成熟过程中卵丘细胞的转录组差异,发现一批有潜在生物学意义和应用前景的基因产物,MKLN1是其中的一个。MKLN1是一种细胞质内的支架蛋白,目前发现其在调节细胞骨架、蛋白转运、结合GABA受体等方面有重要作用。初步的研究发现,卵丘细胞高表达MKLN1,其对应的卵母细胞则具有更好的发育潜能。关于MKLN1在卵丘细胞生物学作用,及其可能参与调节卵母细胞发育成熟的作用,目前尚未见文献报道。本文体外培养小鼠卵泡和卵母细胞-卵丘细胞复合体(COC),利用小RNA干扰的技术靶向降调节卵丘细胞内MKLN1的表达,研究MKLN1在卵丘细胞中的生物学作用,探讨MKLN1通过卵丘细胞作为桥梁间接参与调节卵母细胞成熟及其机制。本研究有助于进一步了解卵丘细胞与卵母细胞间的相互交流,探讨卵丘细胞对于改善卵母细胞体外成熟发育潜能的机制,以及MKLN1是否可能作为改进IVM潜在的靶分子。材料与方法:1.体外培养小鼠卵泡和COCs,IVM前/后分离卵丘细胞和卵母细胞;利用小RNA干扰技术降调节卵丘细胞的MKLN1表达。分别用q RT-PCR和Western blot进行验证干扰效果。2.研究卵丘细胞降调MKLN1对于卵母细胞成熟及发育潜能的影响:对干扰组和对照组进行IVM,比较对应的卵母细胞的成熟率。对于两组同样达到MII的卵母细胞进行IVF,观察其囊胚形成。3.降调节卵丘细胞MKLN1影响卵母细胞成熟,是否通过增加卵丘细胞凋亡的机制?检测干扰组和对照组的卵丘细胞凋亡,采用Annexin-V/PI法进行染色。检测两组卵丘细胞的Bcl-2和Bax m RNA和蛋白质表达水平,初步探讨细胞凋亡相关的机制。4.研究MKLN1调节卵丘细胞凋亡的细胞内机制:通过查询相关数据库和文献,寻找MKLN1的作用蛋白;用免疫共沉淀法进行验证;通过免疫荧光细胞内定位的方法,确定MKLN1及其作用蛋白的定位。5.统计方法:采用SPSS19.0统计软件进行数据分析,计数资料统计采用卡方检验,组间比较采用单因素方差分析。计量资料采用均数±标准差((3±S)的形式表示,两组间比较采用t检验的方法进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.通过q RT-PCR和Western blot验证,发现干扰组相比对照组MKLN1的m RNA表达量和蛋白表达量均降低。2.对两组卵母细胞IVM后成熟率进行对比,发现干扰组相对对照组卵母细胞成熟率降低(42.3%vs70.3%,P<0.05)。此外对两组IVM后卵母细胞进行体外受精,观察囊胚形成率。发现干扰组相对于对照组囊胚形成率降低(40%vs53.7%,P<0.05)。3.对两组卵丘细胞的凋亡进行比较,干扰组卵丘细胞凋亡增加,Bcl-2表达水平降低,Bax表达水平升高。4.通过数据库查找和检索文献,发现MKLN1可能与RANBP9相互作用;通过免疫共沉淀技术得以验证。5.对MKLN1和RANBP9进行细胞内共定位,发现MKLN1主要在细胞质中表达,RANBP9在细胞核和细胞质中均有表达。两者在细胞质中有明显的共定位。结论:1.卵丘细胞中低表达MKLN1,降低该卵丘细胞对应的卵母细胞的发育潜能。2.卵丘细胞低表达MKLN1,增加了卵丘细胞的早期凋亡,可能是IVM卵母细胞成熟率低的原因之一。3.MKLN1可能通过结合RANBP9,调整RANBP9在细胞核与细胞质内分布,或者通过影响RANBP9与下游蛋白的结合作用,进而参与调节卵丘细胞凋亡。4.卵丘细胞中MKLN1及其结合的RANBP9,可作为增强IVM卵母细胞成熟的潜在靶分子来进行研究。