近年研究提示,炎症和免疫是糖尿病肾病的重要发病机制,本研究通过实验研究和临床研究两方面,分别观察NF-κB炎症信号通路,免疫受体Fcγ RIIB/C蛋白在糖尿病肾病发生发展过程中的作用。实验研究：黄芩素在高糖诱导人近端肾小管上皮细胞损伤中的作用和机制研究NF-κB作为一个炎症信号通路的关键因子,其介导的炎症反应在糖尿病肾病的病理发展过程中起着十分重要的作用,但其在糖尿病近端肾小管上皮细胞损伤中的作用尚不明确。本实验通过体外研究发现：NF-κB信号激活参与了高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)损伤；中药黄芩的单体成分—黄芩素,可能通过抑制NF-κB通路激活,减轻高糖诱导的肾脏细胞炎症状态。目的：1.观察高糖对HK-2细胞糖毒性作用及相关信号通路。2.黄芩素干预高糖诱导HK-2细胞损伤的作用及机制研究。方法：不同糖浓度(5.5mM-60mM)和不同甘露醇浓度(30mM,45mM,分别对应各高糖渗透压)孵育HK-2细胞24h,观察细胞活力变化。不同糖浓度(5.5mM-45mM)刺激HK-2细胞24h,观察IκBα-和p65蛋白表达规律。不同剂量的黄芩素(25-200uM)处理未加刺激的HK-2细胞36h,观察细胞活力变化。选择45mM浓度的葡萄糖刺激HK-2细胞24h,将NF-κB特异抑制剂PDTC作为阳性对照,观察不同剂量黄芩素(25-100uM)对高糖诱导的HK-2细胞NF-KB通路激活及其下游炎症因子和细胞外基质的影响。MTT比色法检测细胞活力。Western blot法检测NF-κB信号通路关键蛋白(IKBa、p65、 p-p65、IKKa),及其下游炎症分子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和细胞外基质重要成分IV型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)表达。结果：1.高糖诱导的HK-2细胞糖毒性损伤不同糖浓度(5.5mM、15mM、30mM、45mM、60mM)孵育HK-2细胞24h后,MTT法检测细胞活力。5.5maM浓度的葡萄糖视为正常糖对照组。结果发现不同糖浓度呈浓度依赖性对HK-2细胞活力存在抑制作用,与正常糖对照组比较,除15mM浓度的葡萄糖外(P>0.05),30mM、45mM、60mM浓度的葡萄糖差异有显著性(P<0.05,P<0.01);30mM、45mM浓度的葡萄糖与60mM浓度的葡萄糖比较差异有显著性(P<0.05)；30mM与45mM浓度的葡萄糖比较差异无显著性(P>0.05)。不同甘露醇浓度(35mM,45mM,分别对应各高糖渗透压)孵育HK-2细胞24h后,结果发现与止常糖对照组比较,30mM.45mM浓度的甘露醇对HK-2细胞活力没有明显的抑制作用(P>0.05)；30mM与45maM浓度的甘露醇比较差异无显著性(P>0.05)。上述结果提示高糖诱导的HK-2细胞毒性损伤呈一定的浓度依赖关系,且与渗透压作用无明显关联。结合国内外相关研究及死亡细胞过多会影响实验结果的经验,本研究初步选择5.5mM-45mM浓度的葡萄糖进行下一步实验。2.高糖诱导的HK-2细胞NF-κB通路激活的作用Western blot结果发现：IκBa蛋白表达随着葡萄糖浓度的升高而逐渐降低,与正常糖对照组比较,30mM、45mM浓度的葡萄糖差异有显著性(P<0.05,P<0.01)；30mM与45mM浓度的葡萄糖比较差异无显著性(P>0.05)。p65蛋白随葡萄糖浓度的升高而表达上调,30maM、45mM浓度的葡萄糖与正常糖对照组比较差异有显著性(P<0.05,P<0.01)；30mM与45mM浓度的葡萄糖比较差异无显著性(P>0.05)。提示高糖刺激HK-2细胞下调IκBα蛋白表达和上调p65蛋白表达,呈一定的浓度依赖关系。因此,本研究选择45mM浓度的葡萄糖作为高糖刺激组,进行黄芩素干预实验研究。3.黄芩素对正常培养的HK-2细胞活力的影响MTT法实验结果所示：25uM、50uM、100uM剂量的黄芩素对未加刺激正常培养的HK-2细胞活力没有明显的抑制作用,与空白对照组比较差异无显著性(P>0.05);200uM的黄芩素对正常培养的HK-2细胞活力有明显的抑制作用,与空白对照组比较差异有显著性(P<0.05)。提示200uM剂量的黄芩素对HK-2细胞存在一定的细胞毒性。基于本实验结果,初步选择25uM、50uM、100uM剂量的黄芩素,分别设为黄芩素低剂量组、黄芩素中剂量组、黄芩素高剂量组进行下一步实验。4.黄芩素对高糖诱导的HK-2细胞NF-κB通路激活的作用1)黄芩素干预抑制高糖诱导的HK-2细胞IκBa蛋白表达下调Western blot实验结果所示：100uM的NF-κB特异抑制剂PDTC对高糖诱导的HK-2细胞IκBa蛋白表达下调有明显的抑制作用,与高糖组比较有显著差异(P<0.01)；黄芩素可以剂量依赖性的抑制高糖诱导的HK-2细胞IKBa蛋白表达下调,其中黄芩素中、高剂量组与高糖组比较有显著差异(P<0.05,P<0.01),黄芩素低剂量组与高糖组比较无显著差异(P>0.05)。2)黄芩素抑制高糖诱导的HK-2细胞p65活化Western blot实验结果所示：高糖刺激HK-2细胞24h可显著上调p-p65/p65比值,与正常糖对照组比较有显著差异(P<0.01)；黄芩素中、高剂量组和PDTC组能抑制高糖诱导的HK-2细胞p-p65/p65比值上调,与高糖组比较差异有显著性(P<0.05,P<0.01)；黄芩素低剂量组与高糖组比较无显著差异(P>0.05)。提示高糖通过磷酸化作用活化p65促进其向胞核转位；黄芩素呈一定的剂量依赖关系阻断p65活化。3)黄芩素干预抑制高糖诱导的HK-2细胞IKKa表达Western blot实验结果所示：高糖刺激HK-2细胞24h可显著上调IKKa蛋白表达,与正常糖对照组比较有显著差异(P<0.01)；黄芩素中、高剂量组能下调高糖诱导的HK-2细胞IKKa蛋白表达,与高糖组比较有显著差异(P<0.05,P<0.01)。结合上述结果,提示黄芩素可能通过抑制IKKa介导的IκBα降解和p65磷酸化,抑制NF-κB通路激活。5.黄芩素干预对高糖诱导的HK-2细胞炎症分子MCP-1、ICAM-1表达的影响Western blot实验结果所示：高糖刺激24h可诱导HK-2细胞MCP-1、ICAM-1蛋白表达上调,与正常糖对照组比较有显著差异(P<0.01)；黄芩素中、高剂量组和PDTC组能下调高糖诱导的MCP-1、ICAM-1蛋白表达,与高糖组比较有显著差异(P<0.05,P<0.01)。6.黄芩素干预对高糖诱导的HK-2细胞外基质成分Collagen IV表达的影响Western blot实验结果所示：高糖刺激24h可诱导HK-2细胞Collagen IV蛋白表达上调,与正常糖对照组比较有显著差异(P<0.01)；黄芩素中、高剂量组和PDTC组能下调高糖诱导的Collagen IV蛋白表达,与高糖组比较有显著差异(P<0.05,P<0.01)。结论：1.高糖诱导的HK-2细胞毒性损伤呈一定的浓度依赖关系,且与渗透压作用无明显关联。高糖能够刺激HK-2细胞1KKα/IκBα/p65通路激活,并上调其下游炎症分子MCP-1、ICAM-1表达,及促进ECM成分Collagen IV堆积。2.黄芩素可以通过抑制高糖诱导的HK-2细胞IKKα/IκBα/p65通路激活,下调其下游炎症分子MCP-1、ICAM-1表达,减少ECM成分Collagen IV堆积。提示黄芩素可以通过减轻肾脏细胞炎症来延缓糖尿病肾病的进展,且与抑制NF-κB炎症信号通路的激活密切相关。临床研究：Fcγ RIIB/C与糖尿病肾病相关性及中医证型分析在第一部分研究中,我们证实,炎症最关键的通路NF-kB的激活参与了DN的发生发展。以往的研究发现,促炎症免疫受体Fcγ Rs (Fc gamma receptors)可以刺激外周血中性粒细胞NF-kB通路激活,提示FcyRs与NF-κB密切相关。Fcγ Rs是免疫球蛋白G(IgG)恒定区Fc的受体。最新的研究发现,激活型Fcγ Rs参与免疫复合物介导的糖尿病小鼠肾脏炎症过程,而抑制型Fcγ RIIB能够抑制激活型Fcγ Rs的功能；且C反应蛋白(CRP)参与Fcγ Rs和NF-κB的激活。因此,观察FcγRIIB/C在糖尿病肾病中的表达规律,分析其与超敏C反应蛋白(hs-CRP)等相关指标的关系,对糖尿病肾病的临床与实验研究可能具有一定的价值。目的：1.观察血清Fcγ RIIB/C在糖尿病肾病中的表达规律；2.观察血清hs-CRP在糖尿病肾病中的表达规律;3.分析Fcγ RIIB/C与hs-CRP等相关指标的关系；4.分析糖尿病肾病中医证型分布特点；5.分析糖尿病肾病中医证型与hs-CRP的关系。方法：研究对象为2012年6月至2013年1月我院内分泌科和肾病科住院的2型糖尿病(含糖尿病肾病)患者共53例。参照文献根据尿白蛋白/肌酐比值分为：①糖尿病正常蛋白尿组(DM)：尿白蛋白/肌酐比值<40mg/g,其中男8例,女10例,年龄55.44±14.51岁；②糖尿病微量蛋白尿组(DNl)：尿白蛋白／肌酐比值为40～300mg/g,其中男10例,女8例,年龄59.15±13.45岁；③糖尿病临床蛋白尿组(DN2):尿白蛋白/肌酐比值为>300mg/g,其中男8例,女9例,年龄62.60±8.73岁。另设健康对照组(NC)：10例,其中男4例,女6例,年龄52.00±13.58岁。记录临床基本资料,如年龄、身高、体重、病程、血压、糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血肌酐、胰岛素抵抗指数、超敏C反应蛋白等,并进行中医证型分析。酶联免疫吸附法检测血清Fcγ RIIB/C蛋白水平。结果：1.各组基本临床资料比较结果显示：DN2组患者年龄最大,与NC组比较有显著差别(P<0.05)。DN1组和DN2组患者病程明显延长,与DM组比较有显著差别(P<0.05)。DN1组总胆固醇最高,与DM组比较有显著差别(P<0.05)。NC组、DM组和DN2组低密度脂蛋白低于DN1组,差别具有显著性(P<0.05)。DM组、DN1组和DN2组胰岛素抵抗指数高于NC组,其中DM组和DN2组与NC组比较有显著(P<0.05)。血压、体重指数、甘油三酯、血肌酐、糖化血红蛋白、高密度脂蛋白各组间比较无显著差别(P>0.05)。2.DM组(18.06±5.34)血清Fcγ RIIB/C浓度显著低于NC组(25.28±8.96)、DN1组(26.75±9.15)和DN2组(24.09±8.39),差别具有显著性(P<0.05,P<0.0I)。DN1和DN2组血Fcγ RIIB/C浓度与NC组相近,差别无显著性(P>0.05)。3.DM组(2.06±1.60)、DN1组(3.21±2.20)、DN2组(1.90±2.14)血清hs-CRP浓度显著高于NC组(0.86±0.94)(P<0.05,P<0.01)。DN1组血清hs-CRP浓度高于DM组和DN2组,但三组无显著差异(P>0.05)。4.血清Fcγ RIIB/C仅与hs-CRP呈负相关(r=-0.276,P=0.048),与年龄、病程、血压、体重指数、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血肌酐、胰岛素抵抗指数、尿白蛋白/肌酐比值均无明显相关。5.本证证型中未见阴阳两虚证；阴虚燥热证、气阴两虚证、脾肾气虚证三个本证中,以气阴两虚证为主,显著高于阴虚燥热证、脾肾气虚证(P<0.01)。标证以血瘀证、湿热证为主,血瘀证显著多于湿热证(P<0.01)。6.糖尿病肾病患者本证证型中,阴虚燥热证(2.40±1.06)、气阴两虚证(3.84±1.93)、脾肾气虚证(2.13±0.90)血清hs-CRP浓度显著高于健康对照组(0.86±0.94)(P<0.05,P<0.01),气阴两虚证血清hs-CRP浓度显著高于阴虚燥热、脾肾气虚组(P<0.05)。标证证型中,湿热证(4.28±2.12)、血瘀证(1.83±1.65)血清hs-CRP浓度与健康对照组比较有显著差异(P<0.05,P<0.01)；湿热证血清hs-CRP浓度显著高于血瘀证(P<0.05)。结论：1.糖尿病肾病患者血清Fcγ RIIB/C浓度没有显著变化,不能为糖尿病肾病诊断和治疗提供依据；2.糖尿病肾病患者存在微炎症状态；3.血清Fcγ RIIB/C与微炎症状态呈负相关；4.气阴两虚,瘀血阻络兼夹湿热是糖尿病肾病早中期的基本病机；5. hs-CRP水平与中医证型相关,在一定程度上为中医辨证分型提供客观依据。