绵羊作为全世界重要的家畜,为人类提供了生产和生活必需的肉、毛、奶和其他副产品,羊产业的健康高效发展对于满足人类对动物产品不断增长的需求具有重要意义。快速改良本地品种是动物育种的重要目标,人工选择和杂交育种等技术的运用在提高家畜的生产和繁殖性能方面发挥了重要作用。近年来,基因编辑技术的出现使得动物精准育种具备了更多潜能,该技术在验证靶向基因的功能及定向培育特殊表型的农业（动物）育种中呈现出非常广阔的应用前景。中国作为农业人口大国,亟待通过快速提升家畜的生产性能来满足动物产品快速增长的需求。滩羊作为中国重要的地方绵羊品种,具有耐粗饲、肉质优良等特性,被广大消费者认可。然而滩羊的生产和繁殖性能还需进一步提升。近些年,本团队一直在通过基因编辑来试图系统地增强滩羊的生产性能和繁殖性能,诸如,利用编辑MSTN基因来提高肉产量,在SOCS2基因中引入了单碱基突变来增大滩羊的体格,还在BMPR-1B（Fec BB）基因中引入了突变来提高产羔数等。这一系列研究表明,通过基因编辑可以实现滩羊表型的明显改变。目前,滩羊还具有尾巴大、脂肪厚的特征,大脂尾不仅影响了绵羊的饲料效率,还存在动物福利问题,而且高脂肪含量肉类的市场价值也较低,这不符合现代育种及市场消费的要求。多个基于全基因组关联分析和选择信号筛选的研究表明,PDGFD基因是影响脂尾大小的主效基因。本研究利用基于CRISPR的基因编辑方法来研究PDGFD基因影响绵羊尾脂的功能,并创制了小尾型的基因编辑滩羊,获得的主要研究结果如下:（1）在体外和体内使用CRISPR/Cas9系统靶向滩羊PDGFD基因。应用CRISPR/Cas9系统靶向绵羊PDGFD基因,在胎儿成纤维细胞中最高编辑效率可达47%,在胚胎中编辑效率最高为53.8%（7/13）。随后,本研究使用效率最高的sg RNA（sg RNA3,sg RNA5）创制了15只羔羊,其中7只阳性,编辑效率为46.6%。利用Sanger测序和靶向深度测序证实了阳性羔羊PDGFD靶位点存在实质性编辑,且#04和#03羔羊的编辑效率最高,分别为73.78%和72.4%。此外,取3只阳性羔羊不同组织（皮肤、肌肉、尾脂）进行靶向深度测序,其编辑效率分别为:#03（75.72%、77.65%、36.89%）、#17（37.26%、38.11%、35.08%）和#57（47.8%、38.64%、38.46%）,且未观察到脱靶现象。（2）PDGFD基因编辑羊的表型特征。进一步分析了基于CRISPR/Cas9敲除（PDGFD＿KO）及ABE（PDGFD＿ABE）诱导的起始密码子突变两种方法创制的PDGFD基因编辑滩羊。在早期（30-180天）,相比WT组,PDGFD＿KO和PDGFD＿ABE的羊尾体积均存在一定比例的减少,但是ABE组更为显著（p＜0.01）。在后期（约1.5岁）两组编辑羊的尾体积也均比WT组显著降低（p＜0.05）。两组羊的体重在早期和晚期均没有显示出与WT组的显著差异（p＞0.05）。两组羊尾部脂肪和肌肉H＆E染色组织学分析结果与WT组没有显著差异（p＞0.05）,这表明PDGFD基因可能与尾部脂肪增生而不是尾部脂肪肥大相关。此外,基因编辑羊的血常规检测结果表明,PDGFD基因编辑羊健康状况良好,且与WT绵羊相比,PDGFD基因编辑没有显著影响血常规参数。（3）PDGFD基因编辑和WT绵羊尾部脂肪组织的转录组分析。转录组分析结果表明,与PDGFD＿KO（n=602）相比,PDGFD＿ABE（n=1,514）的DEG（差异表达基因）总数更高。在PDGFD＿ABE中,329个下调DEG被显著富集到82个GO项目中（p＜0.05）,且涉及的GO项目部分与脂质代谢和调节有关。然而,与脂肪形成过程有关的基因在PDGFD＿ABE中轻微的下调。在PDGFD＿KO中,116个下调DEG被显著富集到16个GO项目中（p＜0.05）。然而,没有发现显著的脂肪生成相关的GO途径。KEGG通路分析也呈现出类似的变化趋势,其中在PDGFD＿ABE中,脂肪生成相关通路显著富集（p＜0.05）,而在PDGFD＿KO中无显著差异（p＞0.05）。因此,绵羊PDGFD基因功能缺失可能会影响尾脂的基因表达,改变与脂肪生成相关基因的转录谱,这初步解释了基因编辑羊尾体积变化的潜在原因。（4）PDGFD基因编辑和WT绵羊尾部脂肪组织的蛋白质组分析。对成年（～1.5岁）PDGFD基因编辑滩羊和WT绵羊的尾部脂肪组织进行蛋白质组测序。相比WT,PDGFD＿ABE和PDGFD＿KO的DEP（差异表达蛋白）总数分别为61个和248个。在PDGFD＿ABE和PDGFD＿KO之间,存在12个上调和7个下调的重叠DEP。在PDGFD＿ABE中,42个上调的DEP被显著富集到197个GO项目中（p＜0.05）,涉及的最重要的GO途径与脂肪酸代谢有关。在PDGFD＿KO中,165个上调的DEP被显著富集到399个重要的GO途径中（p＜0.05）,其中最重要的GO途径与脂肪酸氧化和分解代谢有关。KEGG通路分析也显示出相似的趋势,在PDGFD＿ABE和PDGFD＿KO中均有富集到了脂肪酸相关通路。综上,在PDGFD＿ABE和PDGFD＿KO中,DEP的上调与脂肪沉积呈负相关,这可能解释了PDGFD基因编辑绵羊的尾体积减少的现象。总之,本研究使用基于CRISPR的基因编辑技术成功创制了PDGFD基因编辑绵羊,且编辑后评估显示PDGFD基因编辑羊尾巴体积显著减小。转录组和蛋白质组的组学分析揭示了编辑羊尾部脂肪中差异表达基因和差异表达蛋白的分布,表明靶向PDGFD基因可实现对绵羊尾部脂肪中全基因表达谱的影响。本研究进一步验证了PDGFD基因与绵羊尾型之间的关系,展现了编辑PDGFD基因具有定向改变绵羊尾型的潜力。