研究背景和目的近年来年龄相关性黄斑变(age-related macular degeneration,AMD)的发病率逐年上升,其主要病理改变是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞的变性、坏死、丢失。RPE细胞位于视网膜的最外层,其主要功能包括形成血视网膜屏障、分泌神经营养因子、参与视黄醇循环、吞噬感光细胞外节、吸收可见光及抗氧化应激等。RPE细胞正常生理功能的发挥需要充足的能量供给,同时也会产生大量的活性氧类(reactive oxygen species,ROS)。RPE细胞的线粒体是能量产生及ROS清除的关键细胞器,也是RPE细胞最先及最易受到损伤的细胞器。最近研究显示RPE细胞线粒体功能障碍与视网膜色素变性的发生密切相关。干细胞来源的RPE细胞移植是目前治疗AMD等致盲性眼病最有前景的治疗手段,其治疗机制主要包括:短期的神经营养效应(by stander效应)以及长期细胞替代效应(cell replacement)。近来发现间充质干细胞能够通过线粒体交换改善受者细胞功能。考虑到AMD等视网膜变性疾病的发病机制与RPE细胞线粒体功能障碍密切相关,有报道显示RPE细胞系(ARPE19)间可形成TNT结构并进行线粒体交换,目前尚无相关文献报答线粒体交换对RPE细胞功能的影响。本研究主要探索神经干细胞能否与原代分离的LE大鼠和RCS大鼠RPE细胞形成TNT结构并进行线粒体交换,线粒体交换对RPE细胞能量代谢、ROS代谢和细胞增殖的影响。初步探讨线粒体交换这一机制是否参与干细胞治疗视网膜变性疾病。方法:第一部分:小鼠神经干细胞与正常RPE细胞TNT的形成及线粒体交换1.用带有红色荧光和绿色荧光的线粒体特应性标记物(Mitotracker-red,Mitotracker-green)分别标记mNSC与ARPE19细胞后1:1等量直接共培养24 h,于激光扫描共聚焦显微镜下观察TNT的形成及线粒体交换。2.用带有红色荧光和绿色荧光的线粒体特应性标记物(Mitotracker-red,Mitotracker-green)分别标记m NSC与原代分离的LE大鼠来源的RPE细胞后,取等量细胞1:1直接共培养24h,于激光扫描共聚焦显微镜下观察线粒体交换。第二部分:小鼠神经干细胞与rcs大鼠rpe细胞的线粒体交换及其对rpe细胞功能的影响1.收集单独培养的le大鼠来源的原代rpe(le-rpe)、与mnsc等量直接共培养48h后经流式细胞术分选所获得的原代le大鼠rpe细胞(le-rpe/mnsc),采用高效液相色谱检测其腺苷酸含量,采用流式细胞术检测细胞周期、细胞ros水平。2.收集第三代的le大鼠来源的原代rpe细胞(le-rpe)及rcs大鼠来的源rpe细胞(rcs-rpe),采用高效液相色谱检测其腺苷酸含量,采用流式细胞术检测细胞周期、细胞ros水平。3.收集单独培养的rcs大鼠来源的原代rpe细胞(rcs-rpe)、与mnsc等量直接共培养48h后经流式细胞术分选所获得的原代rcs大鼠rpe细胞(rcs-rpe/mnsc),采用高效液相色谱检测其腺苷酸含量,采用流式细胞术检测细胞周期、细胞ros水平。结果:第一部分:小鼠神经干细胞与正常rpe细胞tnt的形成及线粒体交换1.激光扫描共聚焦显微镜下可见mnsc与arpe19细胞共培养24h后形成tnt,并且mnsc通过tnt将线粒体转运至arpe19中。2.激光扫描共聚焦显微镜下观察到le大鼠来源的原代rpe(le-rpe)与mnsc间形成tnt,随着时间的推移,nsc的线粒体通过tnt进入le-rpe中。第二部分:小鼠神经干细胞与rcs大鼠rpe细胞的线粒体交换及其对rpe细胞功能的影响1.le-rpe与mnsc共培养后atp、adp、amp含量以及腺苷酸池总量及能荷均下降,但差异无统计学意义;共培养组ros水平较未共培养组稍有降低,差异无统计学意义;共培养组与未共培养组相比g1期的细胞比例明显降低,s期及g2/m期细胞的比例分别增加,细胞增增殖指数(pi)也明显增加,差异有统计学意义。说明干细胞能够通过将线粒体转运至le-rpe细胞改善其增殖能能力。2.rcs-rpe与le-rpe相比atp、adp、amp含量以及腺苷酸池总量及能荷均下降;rcs-rpe的ros水平高于le-rpe;rcs-rpeg1期的细胞比例高于le-rpe,S期及G2/M期细胞的比例分别低于LE-RPE,细胞增增殖指数低于LE-RPE。差异有统计学意义。说明RCS大鼠来源的RPE细胞存在能量代谢缺陷、抗氧化应激能力缺陷和增殖能力下降。3.RCS-RPE与mNSC共培养后ATP、ADP、AMP含量以及腺苷酸池总量及能荷均下降,但差异无统计学意义;共培养组ROS水平较未共培养组明显降低,差异有统计学意义;共培养组与未共培养组相比G1期的细胞比例明显降低差异有统计学意义,S期及G2/M期细胞的比例分别增加,细胞增增殖指数也明显增加,差异均有统计学意义。说明接收了干细胞的线粒体的RCS-RPE细胞的线粒体相关功能得到改善,能量代谢障碍得到纠正。结论:1.神经干细胞能与ARPE19细胞株及原代分离的RPE细胞形成TNT结构,并通过TNT进行线粒体交换。2.和LE-RPE细胞相比,RCS-RPE细胞ATP含量下降、ROS水平显著升高及细胞增殖能力下降,说明变性RCS大鼠的RPE细胞存在能量代谢缺陷、抗氧化应激能力和增殖能力的缺陷。RCS大鼠RPE细胞和小鼠神经干细胞共培养进行线粒体交换后,RCS大鼠RPE细胞的能量代谢、ROS清除及RPE细胞的增殖能力可得到显著改善。