研究背景及目的新城疫病毒(Newcasle disease virus,NDV)属于禽类病毒,能引起禽类大面积的死亡,给家禽业造成严重的经济损失。NDV病毒对人类基本不致病,但能杀死肿瘤细胞,已被用于抗肿瘤的生物治疗上。2006年以来我们课题组利用从江西省鄱阳湖野鸭分离得到的1株NDV 7793弱毒株进行NDV抗肿瘤治疗的系列研究,积累了大量NDV抗肿瘤生物治疗基础研究的经验。为了能更深入进行研究,我们拟利用真核表达基因工程系统对NDV的表面蛋白进行表达和纯化。NDV含有多种蛋白,其中的血凝素神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin neuraminidase,HN)是固定在病毒囊膜外表面上的蛋白,具有血凝素和神经氨酸酶的功能,在病毒侵染细胞的过程中,HN起到识别细胞膜表面的唾液酸受体和介导病毒吸附细胞膜的作用。HN不仅是NDV引起禽类致病的主要蛋白,而且在NDV发挥抗肿瘤功能上起至关重要的作用,研究HN蛋白的功能有重要意义。为了获得高品质的HN蛋白进行深入的研究,我们将利用昆虫细胞——草地贪夜蛾卵巢细胞系(SF9)来表达NDV 7793HN蛋白,这是我们实验室第一次利用SF9细胞表达NDV 7793弱毒株的HN蛋白。方法1.提取NDV7793的RNA,逆转录成c DNA,通过PCR将HN基因进行点突变,并将Nco I/Xho I酶切位点引入NDV7793HN基因片段。2.将HN基因片段通过酶切和连接的方法连接到p Fast Bac1 HT B质粒载体,以构建p Fast Bac1 HT B-HN重组质粒,将质粒送测序公司进行测序。3.将测序正确的p Fast Bac1 HT B-HN重组质粒转化到感受态细胞DH10Bac TM中,提取HN杆粒,PCR验证HN杆粒。4.用脂质体转染试剂将HN杆粒转入进昆虫SF9细胞中,培养48小时后收取细胞培养上清,获得第一代病毒,接着用一代病毒感染SF9细胞,培养60小时后收取细胞培养上清,获得二代病毒,最后用二代病毒感染SF9细胞,培养72小时后收集细胞,用SDS-PAGE检测HN蛋白的表达。结果1.从NDV 7793病毒中提取出了病毒的RNA,RNA逆转录成了c DNA,PCR扩增出1710bp带有Nco I/Xho I酶切位点的HN基因片段。2.测序结果表明:p Fast Bac1 HT B-HN质粒构建成功,HN中的Xho I酶切位点被去除。3.从DH10Bac TM细胞其取出HN杆粒,PCR验证HN杆粒构建成功。4.SDS-PAGE结果显示在HN杆粒感染的SF9细胞裂解液中比未感染病毒的SF9细胞裂解液在67k Da左右出现了一个明显的条带,这与HN的理论分子量吻合。结论我们成功构建并获得p Fast Bac1 HT B-HN质粒,即HN杆粒,并将该杆粒转染昆虫SF9细胞并得到表达的目的蛋白,初步鉴定为HN蛋白,为今后用基因工程技术获得的HN研究NDV感染宿主细胞(肿瘤细胞)奠定了基础。