论文部分内容阅读
目的：糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病（Diabetesmellitus，DM）全身微血管病变的肾脏特征表现，也是DM病人导致慢性肾衰竭的最主要原因。据统计，I型DM约20%-40%、Ⅱ型DM约10%-20%的患者发生肾脏病变。DN是I型DM最主要死亡原因，在Ⅱ型DM中其严重性仅次于心血管并发症。DN的早期表现为肾小球系膜增生，基膜增厚，细胞外基质积聚，最终导致肾小球硬化。系膜细胞是肾小球内产生细胞外基质的主要固有细胞，通过其自身代谢和功能改变直接影响DN进程。目前DN发病内在机理尚未阐明，但已公认其发生、发展的中心环节是氧化应激。本课题组前期研究结果显示，在DM大鼠肾脏组织中氧化应激反应关键酶—诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的mRNA和蛋白表达水平明显上调，iNOS活性显著增高，其合成的一氧化氮（nitric oxide，NO）大量增加，过量产生的NO与超氧阴离子（superoxide，O2-．）快速反应生成过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite，ONOO-）。ONOO-及其衍生物的氧化能力较H2O2强约2000倍，可造成严重氧化应激损伤。已知核转录因子NF-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是iNOS基因转录最主要的调控因子。NF-кB家族包括p50、p52、p65（Rel-A）、c-Rel和Rel-B五个成员。它们通常以同源或异源二聚体形式存在，其中以p50-p65二聚体最为常见。一般情况下，p50-p65二聚体与NF-кB抑制蛋白（Inhibitory kappa B protein，IкB）以非活性状态的三聚体形式存在于细胞浆中。作为一种快反应转录因子，被激活的NF-кB与IкB解离后入核，结合顺式作用元件，调控下游基因转录。C-肽是胰岛素原分子中连接胰岛素A链与B链的连接肽。人C-肽由31个氨基酸残基组成，分子量3020D，等电点3.0，半衰期30min，主要经肾脏代谢。正常人血浆C-肽基础水平约为0.4nmol/L。最初，C-肽被认为是胰岛素合成过程中的副产物，一种无生物活性的“生物垃圾”。随后，Ｃ肽被发现在胰岛素原分子中对胰岛素原分子的折叠、二硫键的正确配对等分子结构的形成起重要作用，但血液中游离C-肽的生理功能却一直不清楚。近年临床应用和基础研究均发现，C-肽防治DN疗效独特，接近生理浓度的C-肽可部分恢复受损的肾小球功能，抑制细胞外基质增生，明显改善肾小球超微结构，逆转其纤维化。到目前为止，除C-肽外，尚无其它任何药物或治疗方法可有效逆转DN。虽然C-肽有此功能，但作用机制未明，亟待研究。鉴于C-肽能有效逆转DN，而氧化应激已被证明是DN发生的中心环节，氧化应激反应关键酶iNOS主要受到NF-кB调控，我们推测：C-肽通过调控NF-кB—iNOS途径，达到逆转DN的功效。那么，正常（低糖，5mmol/L）和高糖（25mmol/L）状态下培养大鼠肾小球系膜细胞，给予不同浓度的C-肽、作用不同时间后，C-肽在细胞中的功能定位如何；不同C-肽浓度、不同作用时间对细胞中iNOS的表达水平有何影响；高糖处理系膜细胞对其NF-кB的核转位有何影响；一定浓度C-肽作用系膜细胞后，NF-κB的核转位有何变化，未见报道。本实验采用大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1，应用高糖模拟糖尿病高糖状态，应用不同浓度C-肽、作用不同时间进行实验。以免疫荧光染色法观察C-肽在HBZY-1细胞中的功能定位；以实时定量PCR法检测iNOS表达水平的变化，来测定C-肽的有效浓度和起效时间；用免疫荧光染色法，以NF-кBp65亚基为检测标准，来测定NF-кB的核转位及检测C-肽对NF-кB核转位的影响，为深入研究C-肽调控NF-кB—iNOS途径的分子机制奠定实验基础。方法：1细胞培养购买低糖（5mmol/L）DMEM、高糖（25mmol/L）DMEM和0.25%EDTA-胰蛋白酶消化液，用含10%胎牛血清的低糖DMEM，在37℃、5%CO2培养箱中进行细胞培养和传代。2实验设计与分组细胞分组定义：正常组：HBZY-1细胞正常培养（低糖DMEM）后，换成C-肽-低糖DMEM培养；防治组：HBZY-1细胞正常培养后，换成C-肽-高糖DMEM培养；治疗组：HBZY-1细胞高糖DMEM培养24h后，换成C-肽-高糖DMEM培养。2.1探讨治疗组HBZY-1细胞，同一时间点，不同浓度C-肽在细胞内定位情况。治疗组细胞，C-肽-高糖DMEM作用30min，根据C-肽浓度不同分为5组：2、3、4、5、6μmol/L。2.2探讨正常组、防治组和治疗组HBZY-1细胞，同一浓度，不同时间点C-肽在细胞内定位情况。正常组、防治组和治疗组细胞，均加入C-肽浓度5μmol/L的高糖DMEM。正常组和防治组作用时间为：0、5、10、20、40、60、80、100、120min。治疗组作用时间分为：0、5、10、20、40、60min。2.3探讨高糖对HBZY-1细胞中iNOS表达水平的影响。用高糖DMEM培养HBZY-1细胞，根据高糖作用时间不同分为11组：正常对照、高糖0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5h。2.4探讨C-肽对HBZY-1细胞中iNOS表达水平的影响。C-肽-高糖DMEM作用防治组细胞4h，根据C-肽浓度不同分为8组：正常对照、C-肽-高糖0、500、50、5、1、0.5、0.1nmol/L。C-肽-高糖DMEM作用治疗组细胞，根据0.5nmol/L C-肽作用细胞时间不同分为8组：正常对照、C-肽-高糖0、0.5、1、2、4、6、8h。2.5探讨高糖状态下，HBZY-1细胞中NF-кB核转位情况。用高糖DMEM作用HBZY-1细胞，根据高糖作用时间不同分为9组：0、5、10、15、20、25、30、35、40min。用高糖DMEM作用HBZY-1细胞，续40min之后，根据高糖作用时间不同分为34组：45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210min。2.6探讨高糖状态下，C-肽作用后，HBZY-1细胞中NF-кB核转位情况。根据培养条件不同分为3组：正常对照、高糖对照和0.5nmol/LC-肽-高糖DMEM，作用时间为35min。3C-肽功能定位、NF-кB核转位及C-肽影响NF-кB核转位的形态学观察。免疫荧光染色法观察HBZY-1细胞中C-肽的功能定位、NF-кB是否转运到细胞核内、C-肽是否能影响NF-кB的核转位。结果：1治疗组HBZY-1细胞，同一时间点，不同浓度C-肽在细胞内定位情况。免疫荧光显示，各组C-肽主要分布在细胞核内。C-肽在细胞中的荧光强度随C-肽浓度增大而增强，且C-肽浓度为5μmol/L时最为显著。因此选5μmol/L的C-肽为研究C-肽功能定位的最佳浓度。（见Fig.1）2正常组、防治组和治疗组HBZY-1细胞，同一浓度，不同时间点C-肽在细胞内定位情况。免疫荧光显示，正常组细胞在120min内均未检测到C-肽荧光；（见Fig.2A）防治组细胞前60min亦未在细胞内检测到C-肽荧光，但80、100和120min均发现C-肽荧光积聚于核；（见Fig.2B）治疗组细胞5min时即在核内观测到C-肽荧光，且C-肽荧光强度随C-肽加入时间延长而增强，20min时最为显著。（见Fig.2C）3高糖对HBZY-1细胞中iNOS表达水平的影响。Real-time PCR结果显示：细胞中iNOS的表达水平随高糖处理时间延长而升高，以4h（0.5927±0.04709）最为显著。（见Fig.3，Table1）4C-肽对HBZY-1细胞中iNOS表达水平的影响。Real-time PCR结果显示：6种不同浓度C-肽均可抑制防治组细胞iNOS的表达水平，但该抑制作用不随C-肽浓度增大而增强，C-肽浓度为0.5nmol/L时最为显著（0.0437±0.00496）。（见Fig.4A，Table2）随0.5nmol/L浓度C-肽作用于治疗组细胞时间的延长，细胞中iNOS的表达水平被抑制，6h（0.0575±0.00507）最为显著。（见Fig.4B，Table3）5高糖状态下，HBZY-1细胞中NF-кB核转位情况。免疫荧光显示，高糖培养HBZY-1细胞35min时，NF-кB核转位最为显著。（见Fig.5A）由45min到210min，每隔5min观测一次，结果显示：NF-кB核转位具有周期振荡现象，NF-кB从胞浆-胞核-胞浆进出过程需约50min，且趋势渐缓，随高糖刺激时间增长，NF-кB倾向于滞留核内。（见Fig.5B）6高糖状态下，应用C-肽后，HBZY-1细胞中的NF-кB核转位。免疫荧光显示，与高糖对照组相比，C-肽-高糖DMEM组细胞核内NF-кB核转位显著减少。（见Fig.6）结论：1实验证实5μmol/L C-肽是观察其功能定位最佳浓度。2本研究发现：不同糖浓度、时间处理的系膜细胞，对C-肽的通透状态决然不同：C-肽可快速（5min）进入治疗组细胞中，且主要在核内聚集，C-肽荧光强度随其加入时间延长而增强，20min时最为显著；防治组细胞在80min后，始见C-肽进入细胞核；C-肽不进入正常组细胞。但其机制不明，值得探讨。3C-肽可明显抑制高糖引起的系膜细胞iNOS高表达，其抑制强度以0.5nmol/L C-肽浓度最为显著，且该抑制作用不随C-肽浓度增大而增强。4实验观察到：高糖刺激系膜细胞，NF-кB核转位以35min时最为显著。在45min到210min期间观测到：NF-кB核转位具有周期振荡现象，即NF-кB从胞浆-胞核-胞浆进出过程，振荡周期约50min，且NF-кB有随高糖刺激时间延长而滞留于核内的趋势。证实NF-кB的核转位可被0.5nmol/L C-肽明显抑制，NF-кB可能是C-肽调控的重要靶点。