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杆状病毒(Baculoviruses)是一类寄生于节肢动物的杆状的病原微生物，其天然宿主大多是农林业的害虫，因此在世界上被广泛的应用为生物杀虫剂。杆状病毒常常包埋于由蛋白质(polyhedrin/granulin)组成的包涵体基质中。根据包涵体的形态特征，杆状病毒科分为两个属：核多角体病毒属(nucleopolyhedravirus，NPV)和颗粒体病毒属(granulovirus，GV)。家蚕核多角体病毒Bombyxmorinucleopolyhedrovirus(BmNPV)是家蚕(Bombyx mori)的重要病原，给蚕业生产带来重大损失。随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的BmNPV基因功能被发现，这不仅为家蚕疾病的防治与应用提供了理论基础，同时也有助于杆状病毒作为生物杀虫剂、真核表达载体和基因治疗转移载体的应用研究。而且BmNPV可以作为研究大DNA囊膜病毒的良好模型，所以其研究也有助于对其它大DNA基因组囊膜病毒，如痘病毒、疱疹病毒等的研究。BmNPVORF126(Bm126)属于杆状病毒11k家族基因，其同源基因Ac150被认为是一个口服感染因子，但Bm126的功能尚不清楚，因此，本论文对该基因功能进行了系统的研究，论文包括以下章节：
第一章：以综述的形式扼要介绍了杆状病毒的分类特征、基因组结构、病毒复制周期、致病的分子机制及杆状病毒的应用，重点介绍了BmNPV的分子生物学研究、家蚕杆状病毒表达载体的研究与应用、Bm126同源基因的研究现状及本论文研究的目的、内容及意义。
第二章：采用PCR方法克隆了我国不同地方分离株BmNPV的Bm126基因，测定了各个地方株基因编码区的核苷酸全序列。发现了Bm126基因存在与日本分离株T3不同的另外两种新的基因类型(Bm126-SX、Bm126-GD)，其中江苏、浙江、陕西分离株的Bm126序列一致，命名为Bm126-SX(或者SX126);四川和广东分离株的Bm126序列一致命名为Bm126-GD(或者GD126);所有序列演绎的氨基酸序列N端都有一段疏水性很强的氨基酸，C端都有一个C6的基序，二者之间BM126-SX和BM126-GD不同，BM126-SX含有6个ND的重复，BM126-GD则形成一个RGD的基序。为了验证该基因是否能在家蚕中肠中与几丁质结合，将陕西株的Bm126-SX基因插入到原核表达质粒在大肠杆菌中进行了表达、纯化，与几丁质进行体外结合实验，结果表明原核表达产物在体外不能与几丁质结合。
第三章：详细研究了BmNPVBm126基因的转录、蛋白表达及定位。利用3RACE对Bm126基因的转录进行分析，结果表明特异性的mRNA从感染后6小时被检测到，并持续到感染末期；3poly(A)尾紧挨终止密码子下游；对Bm126基因上游的DNA序列分析表明其包含有杆状病毒早期基因启动子的特征序列，说明Bm126基因是一个早期基因。将Bm126-SX基因编码区克隆至原核表达载体pET-28a和pGEX-KG，分别获得pET-126和pGST-126。经IPTG诱导，该基因在大肠杆菌BL21中获得了高效表达，pET-126和pGST-126的表达产物的大小分别为13kDa和37kDa。分别将表达的蛋白产物纯化，免疫家兔制备了抗BmNPVBM126的抗血清，Westemblot检测显示所制备的血清能与BmNPV感染的BmN细胞中产生的BM126发生特异性反应。将BM126的C端与绿色荧光蛋白基因融合，通过瞬时转染BmN细胞研究显示荧光BM126定位于细胞质中，而且有聚集现象，病毒超感染后BM126与绿色荧光蛋白基因融合蛋白的荧光在细胞质中有一定的减弱，但在细胞核中没有发现明显的荧光。
第四章：利用BmNPVBacmid-BmBacJS13(BmNPV陕西株衍生的Bacmid)系统构建了缺失Bm126基因的重组病毒BmBacA126。根据BmNPVT3株的序列构建转移载体，在氯霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的上下游分别克隆上Bm126-SX上游侧翼序列和下游侧翼序列作为同源重组的线性同源臂，将其电转化进含有BmNPVBacmid的大肠杆菌中，用氯霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因替代BmBacjS13中的Bm126-SX编码区域，获得了Bm126-SX基因失活的重组Bacmid-BmBacA126。由于BmNPVBacmid没有多角体基因，为了研究Bm126基因缺失对口服感染的影响，将多角体基因(polh)分别回复至BmNPVBacmid-BmBacjS13和失活Bm126-SX的Bacmid-BmBacA126获得BmBacJS13-ph，BmBacA126-ph。为了进一步比较不同基因型的Bm126对病毒在体内及体外生物特性，分别将广东分离株的Bm126-GD或者陕西分离株的Bm126-SX与多角体基因一起，克隆入供体质粒，通过转座回复到BmBacA126的Tn7位点，获得重组bacminds:BmBacA126-SX-ph、BmBacA126-GD-ph。为了更好的调查病毒的特性，将绿色荧光蛋白报告基因同样克隆入供体质粒，继而转座到BmNPVBacmid构建BmBacJS13-egfp。PCR以及基因组的物理图谱分析显示所有的重组bacminds均正确。
第五章：详细研究了重组病毒的生物学特性以及BV感染性。通过BacmidsDNA的转染以及后续的感染测定显示绿色荧光蛋白能正常扩增(除对照病毒外)，感染细胞内多角体能正常形成，表明Bm126是病毒复制非必需基因。一步生长曲线测定证明该基因缺失后不影响出芽病毒(BV)的产量，利用基因敲除和基因转座回复技术研究表明，缺失Bm126-SX基因的病毒与对照病毒相比在半数致死浓度(LC50)上没有显著差异，但在半数致死时间(ST50)上，缺失病毒比对照病毒延长了12h；当回复Bm126-SX基因时，ST50恢复正常值，而回复Bm126-GD基因时，并没有拯救STso的延长；而回复Bm126-GD基因的病毒能明显增加细胞及虫体内多角体的产量。
第六章：本论文的总结及创新点。
第一章：以综述的形式扼要介绍了杆状病毒的分类特征、基因组结构、病毒复制周期、致病的分子机制及杆状病毒的应用，重点介绍了BmNPV的分子生物学研究、家蚕杆状病毒表达载体的研究与应用、Bm126同源基因的研究现状及本论文研究的目的、内容及意义。
第二章：采用PCR方法克隆了我国不同地方分离株BmNPV的Bm126基因，测定了各个地方株基因编码区的核苷酸全序列。发现了Bm126基因存在与日本分离株T3不同的另外两种新的基因类型(Bm126-SX、Bm126-GD)，其中江苏、浙江、陕西分离株的Bm126序列一致，命名为Bm126-SX(或者SX126);四川和广东分离株的Bm126序列一致命名为Bm126-GD(或者GD126);所有序列演绎的氨基酸序列N端都有一段疏水性很强的氨基酸，C端都有一个C6的基序，二者之间BM126-SX和BM126-GD不同，BM126-SX含有6个ND的重复，BM126-GD则形成一个RGD的基序。为了验证该基因是否能在家蚕中肠中与几丁质结合，将陕西株的Bm126-SX基因插入到原核表达质粒在大肠杆菌中进行了表达、纯化，与几丁质进行体外结合实验，结果表明原核表达产物在体外不能与几丁质结合。
第三章：详细研究了BmNPVBm126基因的转录、蛋白表达及定位。利用3RACE对Bm126基因的转录进行分析，结果表明特异性的mRNA从感染后6小时被检测到，并持续到感染末期；3poly(A)尾紧挨终止密码子下游；对Bm126基因上游的DNA序列分析表明其包含有杆状病毒早期基因启动子的特征序列，说明Bm126基因是一个早期基因。将Bm126-SX基因编码区克隆至原核表达载体pET-28a和pGEX-KG，分别获得pET-126和pGST-126。经IPTG诱导，该基因在大肠杆菌BL21中获得了高效表达，pET-126和pGST-126的表达产物的大小分别为13kDa和37kDa。分别将表达的蛋白产物纯化，免疫家兔制备了抗BmNPVBM126的抗血清，Westemblot检测显示所制备的血清能与BmNPV感染的BmN细胞中产生的BM126发生特异性反应。将BM126的C端与绿色荧光蛋白基因融合，通过瞬时转染BmN细胞研究显示荧光BM126定位于细胞质中，而且有聚集现象，病毒超感染后BM126与绿色荧光蛋白基因融合蛋白的荧光在细胞质中有一定的减弱，但在细胞核中没有发现明显的荧光。
第四章：利用BmNPVBacmid-BmBacJS13(BmNPV陕西株衍生的Bacmid)系统构建了缺失Bm126基因的重组病毒BmBacA126。根据BmNPVT3株的序列构建转移载体，在氯霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的上下游分别克隆上Bm126-SX上游侧翼序列和下游侧翼序列作为同源重组的线性同源臂，将其电转化进含有BmNPVBacmid的大肠杆菌中，用氯霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因替代BmBacjS13中的Bm126-SX编码区域，获得了Bm126-SX基因失活的重组Bacmid-BmBacA126。由于BmNPVBacmid没有多角体基因，为了研究Bm126基因缺失对口服感染的影响，将多角体基因(polh)分别回复至BmNPVBacmid-BmBacjS13和失活Bm126-SX的Bacmid-BmBacA126获得BmBacJS13-ph，BmBacA126-ph。为了进一步比较不同基因型的Bm126对病毒在体内及体外生物特性，分别将广东分离株的Bm126-GD或者陕西分离株的Bm126-SX与多角体基因一起，克隆入供体质粒，通过转座回复到BmBacA126的Tn7位点，获得重组bacminds:BmBacA126-SX-ph、BmBacA126-GD-ph。为了更好的调查病毒的特性，将绿色荧光蛋白报告基因同样克隆入供体质粒，继而转座到BmNPVBacmid构建BmBacJS13-egfp。PCR以及基因组的物理图谱分析显示所有的重组bacminds均正确。
第五章：详细研究了重组病毒的生物学特性以及BV感染性。通过BacmidsDNA的转染以及后续的感染测定显示绿色荧光蛋白能正常扩增(除对照病毒外)，感染细胞内多角体能正常形成，表明Bm126是病毒复制非必需基因。一步生长曲线测定证明该基因缺失后不影响出芽病毒(BV)的产量，利用基因敲除和基因转座回复技术研究表明，缺失Bm126-SX基因的病毒与对照病毒相比在半数致死浓度(LC50)上没有显著差异，但在半数致死时间(ST50)上，缺失病毒比对照病毒延长了12h；当回复Bm126-SX基因时，ST50恢复正常值，而回复Bm126-GD基因时，并没有拯救STso的延长；而回复Bm126-GD基因的病毒能明显增加细胞及虫体内多角体的产量。
第六章：本论文的总结及创新点。