蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)是蛋白质行使其功能的基本方式,也是蛋白质调控细胞功能的基础。大部分的蛋白质相互作用界面以一个α-螺旋为结构特征。在这个α-螺旋上,只有少量的氨基酸残基(hotspots)对PPI起到主要作用。因此,设计能够模拟α-螺旋hotspots的空间分布和理化性质的小分子,可能选择性和高效地干扰PPI,具有成药前景。Bcl-2家族蛋白是内源细胞凋亡通路的主要调控因子,包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。促凋亡蛋白通过一条BH3α-螺旋与抗凋亡蛋白相互作用,决定细胞的凋亡与否。其中,Bim蛋白可以通过BH3α-螺旋,结合两个代表性的抗凋亡蛋白：Mcl-1和Bcl-2,释放并且激活Bak、Bax等促凋亡蛋白,诱导细胞凋亡。因此,设计合成特异性模拟BimBH3α-螺旋上hotspots的小分子,可能广谱地调控Bcl-2家族的PPIs,诱导肿瘤细胞的凋亡,获得潜在的抗癌药物。迄今为止,小分子α-螺旋模拟物(Small molecule a-helix mimetics)只能模拟位于α-螺旋疏水一面上的hotspots o然而,Bim蛋白的BH3a-螺旋的hotspots分布于亲水和疏水两个面上,包括亲水的D67和疏水的L62,165,F69等四个氨基酸残基。尤其是本课题组之前的研究证明,D67是一个“very hot spot"。目前所有已报道的和进入临床实验的小分子BH3α-螺旋模拟物,都不能同时模拟D67和其它疏水hotspots。这一缺陷不但导致了小分子与靶蛋白的亲和力不足,而且降低了小分子的靶向性。这严重限制了Bim模拟分子作为抗癌药物的应用,是小分子α-螺旋物研究领域中的瓶颈问题。本研究通过分析Bim蛋白α-螺旋上的hotspots的空间结构分布,设计合成了首个能够模拟位于Bim蛋白BH3α-螺旋两个面上的hotspots:D67和165的分子骨架A5。这一骨架分子在优化过程中保持了其两面模拟的结合模式,因此为后续的Bim模拟分子的设计提供了结构基础。在A5基础上,我们获得了一系列结构新颖、竞争结合常数在10nM级别的Mcl-1和Bcl-2蛋白双抑制剂：A6-A10。其中A10是亲和力最高的化合物,对Mcl-1蛋白的Ki=13nM,对Bcl-2蛋白的Ki=24nM.1H-15N HSQC结果显示,化合物A10能够模拟位于Bim蛋白α-螺旋两个面上的氨基酸残基：L62、I65和D67,占据Mcl-1蛋白的BH3沟槽。细胞生物学研究结果显示,化合物A10是特异性的Bim模拟物,能够在细胞内解离Bcl-2家族蛋白之间的相互作用,发挥高特异性、高选择性的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。在A5的基础上,本研究设计了一个十字形的刚性分子骨架B1,模拟位于α-螺旋主链两面、两圈的氨基酸残基α-碳的空间分布。最低能量构象的B1分子的四个取代基位点与α-螺旋氨基酸残基i、i+3、i+5和i+7的α-碳的空间分布几乎相同。通过在分子骨架B1上增加四个合适的取代基,获得了化合物C4,其对Mcl-1蛋白的Ki=79nM,对Bcl-2蛋白的Ki=56nM。1H-15N HSQC实验结果显示,化合物C4是第一个能够同时模拟位于Bim蛋白α-螺旋的L62、I65、D67和F69四个hotspots的小分子。本研究不仅首次实现了α-螺旋主链两面、两圈的hotspots的小分子模拟,还通过在分子骨架B1上删除单个或多个基团,首次利用小分子模拟了α-螺旋氨基酸残基的缺失突变,获得了模拟F69A,L62A和F69A/L62A突变的三个系列化合物。通过对这些模拟残基缺失突变分子的构效关系分析,证明了Mcl-1和Bcl-2蛋白与小分子发生分子识别的不同结构基础：对Mcl-1来说,R263与小分子形成的氢键对亲和力贡献更大,而Bcl-2与小分子的亲和力则主要来自于蛋白表面P2、P3和P4三个疏水“口袋”与小分子之间的疏水作用,其中P2口袋贡献最大。本研究还通过基于碎片的药物分子设计(Fragment-based drug design)方法,获得了一系列结构新颖的Mcl-1/Bcl-2蛋白双抑制剂,其中化合物I6对Mcl-1蛋白的Ki=298nM,对Bcl-2蛋白的Ki=1.1μM。同时还为基于碎片的Mcl-l/Bcl-2蛋白双抑制剂的研究提供了新的起始碎片。