研究背景:结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。根据最新的流行病学数据,结直肠癌的发病率位列所有癌症的第三位,其死亡率位列第二位。尽管随着诊疗技术的不断发展,结直肠癌患者的预后已经得到显著的提升,但其死亡率仍不断上升。转移是结直肠癌患者死亡的主要原因,肝脏是结直肠癌结转移的主要靶器官。一旦发生转移,患者的预后则急剧下降。目前仍未有有效的手段减少肝转移的发生以及改善肝转移患者的预后。探索转移机制在结直肠癌临床及基础研究中都具有重要意义。结直肠癌是一种高度异质性的疾病,除不同个体之间的差异外,同一肿瘤的内部也存在异质性,这种异质性与肿瘤的复发、耐药、转移等密切相关。肿瘤干细胞是肿瘤内异质性形成的主要原因之一。针对肿瘤内异质性及肿瘤干细胞的研究对于探究结直肠癌肝转移发生机制具有重要的意义。近年来各种测序技术的发展极大的改变了肿瘤研究的模式。通过高通量测序解析患者的基因表达谱,可以协助临床医生更好的开展个体化精准治疗。但常规的测序手段从而无法将基因的表达结果与细胞原有的空间信息结合。而细胞的空间位置信息对于肿瘤发生发展过程中细胞的分化、细胞间的相互作用等具有重要意义。空间转录组测序是一种新兴的测序技术,它可以提供基因表达的“组织空间信息”以了解特定细胞与组织切片的相对位置关系,为肿瘤研究提供全新的视角。在本研究中,我们拟利用空间转录组测序这一新兴的技术,对结直肠癌肝转移进行检测,并通过生物信息学分析和细胞生物学实验,对肝转移的机制进行深入研究。研究方法:首先我们收取结直肠癌原发灶及肝转移灶的手术样本各2块组织,对上述4块组织通过10x Genomics平台进行空间转录组测序。对得到的测序数据首先进行数据质控,随后对所有检测到spot进行主成分分析初次降维和一致的流形逼近和投影以进行二次降维以及基因表达谱的解析,以探究结直肠癌原发灶及转移灶内的异质性。对聚类后的各Cluster进行细胞周期、EMT等生物行为分析,探究其中各Cluster生物学特性及关键差异基因的变化。随后对各Cluster进行伪时序分析,探究肿瘤转移过程中的细胞发展轨迹,并鉴定其中的关键基因变化。利用Cellphone DB算法对原发灶及转移灶内的细胞间相互作用进行分析,探索其中细胞间通讯的模式。结合TCGA数据库和我科的临床样本,对上述鉴定到的关键基因进行预后分析,并利用细胞系对上述发现进行初步的验证。研究结果:首先,我们收取了行结直肠癌肝转移同期切除的原发灶及转移灶组织各2块。对上述4块组织通过10x Genomics平台进行空间转录组测序,对得到的数据经过质控及聚类后,4块组织共聚类成19个Cluster,其中19个Cluster可分为6个大类,分别是肠癌原发组织、肠癌肝转移组织、原发灶癌旁组织、转移灶癌旁组织、基质细胞以及淋巴滤泡,且每个Cluster有其特征性的基因表达及独特的生物学功能。肿瘤组织所在的Cluster中检测得到的基因数目明显高于其他组织。随后我们分析了各Cluster的细胞周期及部分上皮间质转化状态,对比不同Cluster的基因表达差异,发现转移灶中肿瘤干细胞相关marker在Cluster12中得到富集且伴随着FOXD1表达升高。随后,对所有的spot进行轨迹和伪时间发现所有的肿瘤spot呈现2条分化轨迹,结合所有spot的空间信息,发现转移灶形成的过程中,肿瘤细胞先经历去分化形成转移灶,随后在转移灶中经历再分化使其在转移灶中定植。其中Cluster12呈现分化最低的状态,符合其肿瘤干细胞marker高表达的特征。进一步对Cluster12的基因表达情况分析发现其中Hippo通路及WNT/β-catenin呈现激活,提示FOXD1、Hippo通路及WNT/β-catenin通路在维持肿瘤干性中的相关性。随后,利用Cellphone DB分析细胞间相互作用,发现CD74-MIF在转移组织中的肿瘤细胞间有显着的相互作用。基于上述研究发现FOXD1在转移灶中Cluster12中表达,我们首先利用TCGA数据库发现FOXD1高表达患者其预后较差,且将FOXD1与临床病理信息相结合,构建的预后预测模型具有良好的预测效能。随后我们构建了FOXD1敲低及过表达的细胞系,发现FOXD1过表达引起YAP及β-catenin表达升高;敲低FOXD1则降低YAP及β-catenin的表达,此外FOXD1能够调控肿瘤细胞分泌MIF。综上所述,我们利用空间转录组测序技术对结直肠癌肝转移进行了深入的研究,结果显示肿瘤干细胞在肝转移灶中呈现富集,且转移发生的过程中肿瘤经历去分化及再分化的过程。此外,我们发现转录因子FOXD1可调控Hippo及WNT/β-catenin通路调控参与到结直肠癌转移的过程中。上述结果为结直肠癌肝转移的研究提供了新的研究方向。