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临床骨科患者中可观察到骨折生理性愈合,以及病理性的骨延迟愈合、骨不愈合等过程,其生物学机制复杂,是目前研究领域的热点和难点。近年研究显示,经典及非经典Wnt信号通路在调控骨组织愈合过程中至关重要,同时外周神经系统分泌的神经肽类物质也在骨组织愈合中发挥重要作用。基于上述事实,本研究拟回答下列几个问题:1神经肽类物质是否通过Wnt信号通路调控骨组织愈合;2该调控的具体分子机制如何;3该调控的细胞生物学效应如何。第1部分:探讨骨折愈合模型中Wnt信号通路的表达情况及神经肽类物质对其的调控效应。目的:筛选可能调控经典及非经典Wnt信号通路的神经肽类物质并初步探讨其效应。方法:首先,通过制作小鼠骨折模型,于术后一周获取小鼠的骨折愈合骨痂组织,分析组织内神经肽类物质如降钙素基因相关肽（Calcitonin generelated peptide,CGRP）、P物质（Substance p,SP）、血管活性肠肽（Vasoactive Intestinal Peptide,VIP）和神经肽Y（Neuropeptide Y,NPY）,以及经典Wnt信号通路配体Wnt3a及非经典Wnt信号通路配体Wnt5a的基因表达情况。其次,在体外获取小鼠骨髓基质干细胞以及骨髓源巨噬细胞,检测几种神经肽对经典和非经典Wnt信号通路的效应。结果:骨折愈合过程中CGRP、SP、VIP和NPY蛋白浓度均存在不同程度的增高,同时Wnt信号通路配体Wnt3a和Wnt5a也处于高转录状态,提示其可能存在联系。进一步体外实验的基因及蛋白分析结果显示:CGRP和SP仅可激活经典Wnt信号通路蛋白Wnt3a的表达;VIP对Wnt信号通路无明显效应;NPY可激活非经典Wnt信号通路蛋白Wnt5a的表达,并同时促进经典Wnt信号通路蛋白Wnt3a的表达。进一步体外实验结果显示,NPY对经典Wnt信号通路的核心蛋白β-链蛋白（β-catenin）的基因转录无显著效应,但可以促进非经典Wnt信号通路中JNK和NLK的基因转录;NPY在较高浓度下（10-88 mol/L,10-1010 mol/L）促进成骨标志物ALP和RunX2的基因表达,而在较低浓度下（10-1212 mol/L）促进破骨标志物RANK的基因表达。结论:NPY在骨折愈合过程中可同时激活经典及非经典Wnt信号通路。NPY促进成骨分化和破骨分化可能具有浓度依赖性。第2部分:通过建立siRNA转染模型抑制β-catenin及NLK研究神经肽Y对Wnt信号通路的调控作用。目的:探索NPY对经典及非经典Wnt信号通路的调控作用。方法:分别在小鼠类成骨细胞MC3T3-E1细胞和破骨前体细胞RAW264.7细胞中,建立siRNA转染抑制β-catenin、NLK及JNK的模型,同时检测NPY对经典及非经典Wnt信号通路的激活情况。分别采用10-1010 mol/L和10-1212 mol/L两种浓度的NPY刺激MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞;测定经典Wnt信号通路中β-catenin和调节蛋白糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的磷酸化改变,下游基因Tcf1转录水平;测定非经典Wnt/Ca2+通路的Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、蛋白激酶C（PKC）;测定非经典Wnt/细胞极性通路（PCP）的JNK表达。结果:NPY虽然不抑制β-catenin的总量表达,但是可以降低MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞内β-catenin的磷酸化比例,进而促进其介导的经典Wnt信号通路激活,及其下游基因Lcf1的激活,而此效应在β-catenin（-/-）细胞中减弱;NPY单独刺激并不改变p-GSK-3β和β-catenin含量,但可以促进β-catenin入核,增加下游靶基因转录来激活经典Wnt信号通路;NPY可通过CaMKⅡ和PKC激活MC3T3-E1细胞的Wnt/Ca2+通路,此效应在NLK（-/-）模型中失效;NPY可激活RAW264.7细胞的Wnt/PCP通路,此效应在JNK（-/-）模型中失效。结论:NPY可以激活小鼠类成骨细胞MC3T3-E1细胞和破骨前体细胞RAW264.7细胞经典及非经典Wnt信号通路信号转导,因此可能在骨折愈合中发挥重要作用。第3部分:神经肽Y通过Wnt信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化和RAW264.7细胞破骨分化。目的:研究NPY通过调控经典及非经典Wnt信号通路在骨折愈合过程中所产生的具体生物学效应。方法:首先研究NPY对MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化的影响,并通过siRNA转染模型观察了成骨相关基因如RunX2、碱性磷酸酶（ALP）等表达情况。其次研究了NPY对破骨前体细胞RAW264.7细胞破骨分化过程中核因子κB受体活化因子（RANK）、核因子κB（NF-κB）等的表达情况。结果:NPY可以调控MC3T3-E1细胞的增殖、凋亡和成骨分化,并同时促进RAW264.7细胞破骨分化。同时,NPY还可以通过激活Wnt/Ca2+促进MC3T3-E1细胞成骨分化,通过Wnt/PCP通路促进RAW264.7细胞破骨分化。结论:NPY可促进小鼠MC3T3-E1的增殖并减少其凋亡,NPY可能通过激活经典及非经典Wnt信号通路,加速骨折愈合。综合本研究的结果,可以得出以下结论:外周神经分泌的神经肽NPY,可以通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路促进骨折愈合。NPY可以激活非经典Wnt/Ca2+和Wnt/PCP通路促进成骨分化和破骨分化。且上述NPY的生物学效应存在一定浓度依赖性。本研究结果进一步揭示了解神经肽Y在骨代谢过程中的作用机制,为我们在骨折、骨缺损以及骨代谢性疾病的临床治疗方面提供新的思路和科学依据。