论文部分内容阅读
目的:本文旨在探究450 nm LED蓝光对人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）铁死亡和坏死性凋亡的影响及其相关机制,为深入研究视网膜蓝光损伤类疾病提供新思路和理论依据。实验方法:构建辐照强度分别为15 m W/cm~2和25 m W/cm~2的LED蓝光照射模型,对体外培养的ARPE-19细胞连续照射3 h、6 h、9 h和12 h,用倒置相差显微镜观察蓝光照射后即刻和蓝光照射后24 h细胞形态学变化,用接触式测温仪检测各组细胞培养基温度变化,钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein-AM）活细胞染色法检测各组细胞活性变化,CCK-8法检测各组细胞的增殖活力。选取25 m W/cm~2的LED蓝光照射模型,对连续照射6 h和12 h后24 h的两组细胞应用真核有参转录组测序技术观察蓝光照射后ARPE-19细胞表达谱改变情况,并进行差异基因功能、信号通路富集分析和蛋白质互作网络分析,最后应用RT-PCR法和Western blot印迹法检测蓝光照射后铁死亡标志物、坏死性凋亡标志物和DNA损伤标记物磷酸化组蛋白（γ-H2AX）的表达水平的变化。实验结果:1.随着蓝光照射时间的增加,细胞开始收缩、肿胀、变圆,细胞间隙变大和出现漂浮（死亡）细胞。辐照强度为15 m W/cm~2的蓝光照射结束后24 h,细胞形态恢复到正常水平;辐照强度为25 m W/cm~2的蓝光照射结束后24 h,连续照射3 h组和6 h组细胞形态恢复到正常水平,而连续照射9 h组和12 h组开始出现漂浮细胞,尤其是12 h组,细胞基本全部漂浮。蓝光照射会引起细胞培养基温度的明显升高（P＜0.01）。活细胞染色结果显示,辐照强度为25 m W/cm~2的蓝光连续照射9 h组明显出现未染色的死细胞。CCK-8法结果显示,与未照射组比较,蓝光照射各组细胞增殖活力均显著减低（P＜0.001）,但随着照射时间的延长细胞增殖活力减低的速度变慢。2.转录组测序结果显示,蓝光照射后细胞表达谱发生明显改变,与未照射组比较,连续照射6 h组和12 h组分别有4894和5012个差异表达基因;与6 h组比较,连续照射12 h组共有166个差异表达基因。进一步分析各组上调和下调差异基因的表达数量发现,上调差异基因数量多于下调差异基因,且有56个差异基因在连续照射过程中呈持续性表达。与未照射组比较,连续照射6 h组差异表达基因主要集中在氧化应激、调节代谢、细胞增殖及信号转导功能方面;而信号通路差异基因主要集中在膜成分分解代谢、DNA损伤与修复、氨基酸合成、免疫信号通路激活以及细胞凋亡等方面。与连续照射6h组比较,12 h组差异表达基因主要集中在对温度的响应、小RNA的代谢与修饰及对氧气水平的响应功能等方面;而信号通路差异基因主要集中在细胞凋亡等方面。蛋白质互作网络分析（Cytoscape软件）结果表明,与未照射组比较,连续照射6 h组中细胞周期蛋白B1（CCNB1）、微小染色体维持蛋白4（MCM4）、微小染色体维持蛋白4（MCM2）和细胞分裂周期蛋白6（CDC6）可能是最重要的网络互作蛋白;与连续照射6 h组比较,12 h组中白细胞介素1β（IL1β）、早期生长应答蛋白1（EGR1）、DNA损伤诱导转录因子3（DDIT3）、热休克蛋白A1A（HSPA1A）可能是最重要的网络互作蛋白。3.与未照射组比较,照射结束后24 h,连续照射3 h组铁死亡相关基因NCOA4、FTL、FTH1、HMOX1、SLC39A14表达水平显著提高（均P＜0.001）,SLC3A2、GPX4、SLC7A11表达水平显著降低（均P＜0.001）,连续照射6 h组铁死亡相关基因LPCAP3、P53显著提高（均P＜0.001）;连续照射3 h组细胞铁离子浓度相对于未照射组明显增加（P＜0.01）。4.与未照射组比较,照射结束后24 h,连续照射各组ARPE-19细胞坏死性凋亡标记物RIPK1、RIPK3和P-MLKL以及DNA损伤标志物γ-H2AX蛋白的表达量均明显增加（P＜0.01）;且连续照射12 h组RIPK1蛋白、RIPK3蛋白、P-MLKL蛋白表达量和γ-H2AX蛋白表达量均达到最大。结论:1.蓝光连续性照射可以诱导ARPE-19细胞损伤,且损伤程度与辐照强度和照射时间有关,但随着照射时间的延长损伤加重的速度变慢。2.转录组测序结果显示蓝光照射后会引起细胞表达谱发生显著改变,蓝光照射过程中,细胞启动应激调节程序,DNA受损且分裂减慢;Notch、MAPK和m TOR等多种免疫信号通路被激活,最终可能引起细胞自噬或铁死亡;且CCNB1、MCM4、MCM2、CDC6蛋白和IL1β、EGR1、DDIT3、HSPA1A蛋白可能分别在连续照射6 h和12 h时ARPE-19细胞的损伤效应中发挥着重要作用。3.蓝光连续照射可以诱导ARPE-19细胞铁死亡,且主要发生在轻度损伤的细胞中。4.蓝光连续照射可以诱导ARPE-19细胞坏死性凋亡,且主要发生在重度损伤的细胞中,DNA损伤程度与坏死性凋亡的发生可能存在一定的关联。