论文部分内容阅读
细菌耐药性问题已成为全球关注的热点问题。海岸带地区密集的人类活动导致大量污染物排放到环境中,造成潜在的生态健康风险。抗生素在人类疾病治疗、畜禽养殖、水产养殖等领域得到广泛应用,但抗生素滥用状况愈发严重,导致抗生素抗性基因（ARGs）、耐药菌（ARB）,甚至多重耐药菌（MARB）的累积和扩散,从而对生态环境和人类健康造成了潜在威胁。文献调研发现,目前针对我国整体海岸带环境中ARGs污染状况的系统研究报道极为有限。因此,本文系统研究了我国海岸带环境中ARGs的分布特征、典型界面过程及污染阻控机制。研究内容主要分为三部分:（1）海岸带水环境中抗生素抗性基因的分布特征对黄渤海和相应海岸带区域（鸭绿江口至长江口）进行大规模采样,实时荧光定量PCR（q PCR）定量结果表明,ARGs丰度呈现海岸带>渤海>黄海、近岸>离岸、内湾>湾口的特征。目的ARGs总丰度在海岸带区域为1.23×10~4-3.94×10~5copies/m L,比黄渤海海域高1-4个数量级,且在海岸带区域及黄海海域波动较大。黄渤海海域磺胺类ARGs丰度较高,而海岸带区域喹诺酮类ARGs丰度较高。共现性网络分析结果表明黄海区域潜在的多药耐药菌相对丰度较高。使用宏基因组学和qPCR技术对我国整体海岸带区域（鸭绿江口至钦州湾）ARGs的分布进行了调研,海岸带水体ARGs丰度呈现显著的时空分布差异。q PCR研究结果表明,夏冬季节目的ARGs平均丰度分别为8.79×10~4和1.39×10~5copies/m L,远低于海水养殖尾水中ARGs丰度,且喹诺酮类ARGs在海岸带水环境中丰度最高。对比发现,我国海岸带区域ARGs丰度与世界其它国家和地区相当。对我国整体海岸带ARGs污染状况的研究可为后续研究提供参考依据。在受密集人类活动影响的典型半封闭海湾（四十里湾）,目的ARGs在不同功能区呈现显著差异,污水处理厂和入海河流排放影响区域ARGs总丰度最高分别达到6.1×10~6和6.2×10~7 copies/m L。总氮、亚硝酸盐等环境因子与ARGs呈显著相关关系。共现性网络分析显示,受污水排放影响区域微生物种群与ARGs间的强显著相关关系相比其它区域更为复杂,且普遍存在潜在的ARGs宿主菌和多重耐药菌。水产养殖系统是海岸带地区污染的重要源头,利用宏基因组学技术研究了海岸带传统直流水养殖系统（ZZ）和循环水养殖系统（DF和IRMC）中ARGs的分布特征。通过与SARG v2.0综合数据库进行比对,IRMC系统中共检出247种ARGs亚型。16S r RNA基因拷贝数、细胞数量和总reads数定量结果显示,IRMC体系水样中ARGs的丰度分别为0.04-0.14 copies/16S r RNA gene copies、0.04-0.19 copies/cell和15.5-16.7 ppm。四环素类、磺胺类及多重耐药等类型ARGs在水产养殖系统普遍存在,养殖池和废水处理单元中ARGs丰度相对较高,Vibrio等为潜在的多重耐药致病菌。水产养殖系统是海岸带区域重要的ARGs储蓄库。（2）海岸带环境中抗生素抗性基因的典型界面过程ARGs在沉积物-水体间的界面过程研究显示,ARGs在沉积物和水相间的分配系数均大于1.0 L/g,ARGs易于在沉积物中累积。渤海区域沉积物中目的ARGs总丰度最高达4.9×10~8 copies/g,磺胺类ARGs分布最广且丰度最高（5.7×10~4-1.8×10~7 copies/g）,β-内酰胺类ARGs丰度相对较低。等值线地图显示ARGs在莱州湾、渤海湾局部和渤海海域东部丰度较高。共现性网络分析显示渤海周边海岸带地区ARGs潜在宿主菌相对丰度较高于渤海海域。海岸带工厂化循环水养殖系统水样中分离出的悬浮颗粒物中以微塑料最具代表性。ARGs在微塑料-水体间的界面过程研究显示,微塑料样品中目的ARGs丰度为1.59×10~9-1.83×10~9 copies/g,比相应水样中高3-4个数量级。微塑料样品中微生物多样性同样显著高于水样,且包含多种潜在的ARGs宿主菌和多重耐药菌。研究表明微塑料是ARGs和ARGs潜在宿主菌的重要载体。耐药菌在微塑料-水体间的界面过程研究显示,微塑料样品中可培养ARB菌落数为相应水样中的100-5000倍,且耐药菌在总可培养菌中所占比例显著高于水样。高通量测序结果显示微塑料样品中可培养ARB多样性和丰度均显著高于水样,优势菌为Vibrio、Muricauda和Ruegeria等。在分离得到的160株MARB中,微塑料样品所分离菌株中ARGs检出率、int I1基因盒和基因盒阵列种类均高于水样。研究表明微塑料是耐药菌和多重耐药菌的重要载体。（3）海岸带环境中抗生素抗性基因的污染阻控机制以城镇污水处理厂为研究对象,以传统厌氧-缺氧-好氧工艺（AAO）为对照,研究集成膜工艺（IMR）对ARGs的去除效果。IMR工艺出水中ARGs丰度为4.03×10~4 copies/m L,比进水中低2-3个数量级。IMR工艺出水中ARGs日流量降低至（1.02±1.37）×1014 copies/day,比传统AAO工艺降低1-3个数量级。共现性网络分析显示IMR工艺对潜在多重耐药菌有较好的去除效果。集成膜工艺是污水处理过程中ARGs和潜在多重耐药菌去除的有效措施。以海岸带水产养殖尾水为处理对象,构建了高溶解氧（DO）条件下的SNAD（同步短程硝化-厌氧氨氧化-反硝化）生物反应器（HO-SNAD）,可在自然条件下运行,无额外碳源添加。反应器运行60天后达到稳定状态,出水中氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、化学需氧量浓度均值分别为0.26、0.75、0.47和0.27 mg/L。反应器不同水处理单元中氮功能菌群存在显著差异,不同氮功能基因和菌群之间存在复杂的强显著相关关系。反应器出水和出水口填料表面生物膜中目的ARGs丰度分别降低0.46-0.76和0.27-1.24个log值。微生物和功能基因的协同作用,实现了高溶解氧条件下养殖尾水中氮素和ARGs的同步去除。水产养殖系统中抗菌肽对ARGs的调控研究显示,对比抗菌肽与抗生素饲料实验组,抗菌肽组磺胺类、四环素类、大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖苷类和β-内酰胺类ARGs丰度在养殖水体、粪便残饵和鱼肉组织中均普遍较低。共现性网络分析显示,抗菌肽组潜在多重耐药菌相对丰度显著低于抗生素组。抗菌肽对于调控养殖环境,降低ARGs丰度及潜在多重耐药菌丰度具有一定作用。