黄精是一种药食同源的中药材,其中含有多种对人体有益的活性成分。黄精多糖作为黄精的主要成分,具有多种生物活性,因此具有很高的应用价值。多糖是一种广泛存在于动物和植物细胞中天然大分子物质,是构成生命的四大基本物质之一。研究表明,多糖具有抗肿瘤、调节血糖和血脂、抑菌和抗炎、调节免疫等作用,在功能食品、医疗保健方面具有良好的发展应用前景。近年来,中药多糖的免疫调节作用成为研究热点,取得了很大的进展。虽然对黄精及其多糖的研究有不少文献报道,但大多集中在黄精多糖的提取分离纯化,粗提物抑制肿瘤生长、调节血糖、改善记忆等功效的研究,而黄精多糖纯提取物的结构鉴定及其免疫调节等生物活性的研究相对较少,并且从体内和体外实验、细胞分子水平和基因水平阐明黄精多糖对细胞信号转导途径的调节及其交互作用,找出其关键环节,对于揭示生物学功能的发生机制具有重大意义。巨噬细胞作为一种免疫细胞,具有吞噬和介入炎症反应的作用,它广泛分布于机体不同组织中,在天然免疫中发挥着重要作用。近年来,大量体内外研究证明,许多天然多糖具有调节巨噬细胞功能的作用。黄精多糖具有多种重要的生物学活性,其中最重要的就是免疫调节作用,其可以作为免疫调节剂,通过免疫调节来提升机体的免疫防御能力。本课题有关黄精多糖的分离、鉴定及免疫调节功效的主要研究内容分为三部分:(1)黄精多糖的制备、纯化、分离以及抗氧化性能评价,(2)黄精多糖在巨噬细胞RAW264.7体外免疫调节以及信号通路研究,(3)环磷酰胺所致免疫低下小鼠的体内免疫调节作用及其机制。黄精多糖的制备和评价研究内容包括提取、纯化、分离以及抗氧化性能的考察。利用水提醇沉法将黄精多糖从黄精中提取出来,利用Sevage试剂脱蛋白、活性炭吸附法脱色,将所得到的黄精粗多糖进行纯化。采用DEAE-SepharoseFast Flow离子交换色谱对黄精多糖进一步分离纯化,得到四种组分,分别命名为PSP1、PSP2、PSP3、PSP4。采用红外光谱和核磁共振分析对分离得到的黄精多糖进行初步结构鉴定,通过Size exclusion chromatography测定了黄精多糖的分子量,通过HPLC柱前衍生化法测定了黄精多糖的单糖组成;体外抗氧化实验表明,黄精多糖具有较好的自由基清除能力和还原能力。黄精多糖体外免疫疗效的考察由巨噬细胞RAW264.7吞噬能力、一氧化氮和细胞因子调节以及信号通路研究组成。本实验选用的细胞模型为小鼠RAW264.7巨噬细胞系,利用中性红实验测定了巨噬细胞的吞噬能力,通过硝酸还原酶法测定细胞上清中的一氧化氮(NO)含量,细胞因子IL-6和TNF-α的含量以及它们对应的mRNA的表达分别通过酶联免疫吸附法和RT-PCR来测定。利用Western Blot 方法检测了 RAW264.7 细胞中 p38 MAPK、I1κB-α、NF-κB p65、iNOS 和 COX-2的蛋白表达,并用免疫荧光法检测了 NF-κBP65的核转移。结果表明黄精多糖可以促进巨噬细胞吞噬,增加NO、TNF-α和IL-6的分泌。在机制方面,黄精多糖促进了 IκB-α降解,增强了 p38 MAPK、NF-κB p65、iNOS 和 COX-2 的表达,并呈良好的剂量依赖关系,同时提升了 NF-κB的核转移过程。实验结果说明,黄精多糖具有明显的免疫增强活性,进一步表明其有助于促进细胞介导免疫反应。黄精多糖体内免疫调节作用研究包括:环磷酰胺所致免疫低下小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬能力,脾脏T和B淋巴细胞增殖能力,血清中细胞因子的免疫应答。采用环磷酰胺建造非特异性免疫功能低下的实验动物模型,分别从免疫器官指数、免疫细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞、腹腔巨噬细胞)活性以及细胞因子(TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10)的变化等方面考察了黄精多糖免疫调节作用。结果表明:黄精多糖不但能够提高免疫细胞的活性,同时还可以调节血清中TNF-α、IL-2、IL-8和IL-10等因子的水平,进而平衡Th1和Th2。换句话说,黄精多糖能够提高机体免疫力。综上所述,本课题首先提取纯化了黄精多糖并对其结构和理化性质进行了评价;巨噬细胞RAW264.7体外免疫活性实验结果表明,黄精多糖能够显著提高细胞吞噬能力,增强一氧化氮和细胞因子免疫调节活性,其免疫作用机制是通过调节P38 MAPK和NF-κB信号通路来实现的;环磷酰胺所致免疫低下小鼠体内实验显示,黄精多糖能够增强腹腔巨噬细胞吞噬能力以及脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力,提升血清中细胞因子的免疫应答。本课题从体内体外两个方面探索了黄精多糖免疫调节活性和作用机制,为进一步开发利用黄精中药材提供了崭新的免疫治疗思路与途径。