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小花棘豆是内蒙古一种主要疯草,其有毒成分为苦马豆素,苦马豆素抑制动物细胞内的甘露糖苷酶,牲畜采食小花棘豆导致中毒,对草原畜牧业造成重大损失,苦马豆素毒性由小花棘豆Embellisia内生真菌引起,而该真菌中苦马豆素的生化代谢途径未知。2012年有研究发现,美国分布其他疯草内生真菌中如果缺乏酵母氨酸还原酶,则苦马豆素及其前体的含量增加,而酵母氨酸和赖氨酸含量降低。本研究首次以小花棘豆Embellisia内生真菌OW7.8菌株为研究对象,应用简并PCR技术克隆真菌的酵母氨酸还原酶基因中间片段,利用RACE技术克隆该基因cDNA全长序列,根据cDNA序列设计引物,扩增了酵母氨酸还原酶基因。在此基础上用基因工程技术上设计OW7.8的酵母氨酸还原酶基因缺失载体,为研究在小花棘豆Embellisia内生真菌中该基因对苦马豆素合成的影响奠定基础。主要研究结果如下：1.利用简并PCR技术得到了875bp的OW7.8的酵母氨酸还原酶基因片段,与美国疯草内生真菌的酵母氨酸还原酶基因序列一致度为99%。2.通过3’RACE获得了873bp的OW7.8酵母氨酸还原酶cDNA3’末端序列,而5’RACE获得了836bp5’末端的OW7.8酵母氨酸还原酶cDNA序列,两段序列拼接得到了1419bp的完整的开放读码框(ORF)以及143bp的3’非翻译区(UTR)序列,与美国疯草内生真菌的酵母氨酸还原酶基因的cDNA序列一致度为82.3%。3.根据OW7.8酵母氨酸还原酶基因cDNA序列设计引物,以其基因组DNA为模板,扩增得到全长为1750bp的酵母氨酸还原酶基因序列,该序列从ATG起始至3’非翻译区。4.以pUC19为出发质粒,构建了含潮霉素抗性基因为选择标记基因的OW7.8酵母氨酸还原酶基因缺失载体,目的DNA中间部分为潮霉素抗性基因hph,两端分别是酵母氨酸还原酶基因的5’端和3’端序列。