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目的:蛋白酶激活受体-2(Proteinase-actived receptors 2,PAR-2)是位于细胞膜表面的G蛋白偶联受体,该受体被激活后可引起一系列关于肿瘤生长、侵袭、转移等方面的生物学行为。食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,其发生机制目前还不太明确,是当前食管癌研究中重要的一个方面。研究表明,在多种肿瘤组织及细胞中存在PAR-2的高表达,提示PAR-2可能与肿瘤的生物学特性和恶性程度密切相关。关于PAR-2对食管癌EC109细胞增殖的影响及其分子机制,目前尚不清楚。本试验通过体外培养人食管癌细胞株EC109,研究PAR-2对食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖的影响,并探讨其调节作用的可能分子机制。方法:细胞培养:用含有10%新生牛血清的1640培养基,置于37℃、5%CO2饱和湿度的孵育箱中培养,待细胞长满培养瓶底部70-80%(约2-3 d)时用胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。细胞转染:显微镜观察细胞生长情况;使用一次性无菌吸管将培养瓶中的废液吸除,使用PBS漂洗2遍;用移液枪加入1 ml Trypsin液,消化3 min(37℃,5%CO2),加入1ml的含血清培养基终止反应,使用一次性无菌吸管吹打培养瓶壁,将培养液装入离心管中,离心;用培养液重悬细胞,细胞计数后选择6×104/ml的密度加入不含抗生素培养基的培养瓶中,将培养瓶转入培养箱中培养,第二天转染;将细胞同上进行消化离心,取1.5ml EP管,标记为1,加入100μl 1640培养基,再加入2μg含PAR-2 shRNA的质粒,静止5 min;另取1.5 ml EP管,标记为2,加入100μl 1640培养基,再加入10μl X-tremeGENE HP DNA Transf,静止5 min;将两管混匀,静止15 min,后再次加入不含抗生素培养基的培养瓶中,培养24-48h后,使用荧光显微镜观察转染效果;使用G418对PAR-2 shRNA转染后的细胞进行筛选,不被转染的细胞不具备G418抗体,会被G418杀死,剩余细胞为PAR-2 shRNA转染成功细胞,用于后续实验。将食管癌细胞按不同处理方法分为空白组、PAR-2激动组(加入SLIGKV)、PAR-2反激动组(加入VKGILS)、PAR-2 shRNA组(shRNA转染)和MAPK抑制组(pd98059)。每组处理前首先使用不含小牛血清的1640培养基饥饿培养24h,在按相应的处理原则加入药品或阻断剂。每组处理结束后,使用rt-pcr检测par-2mrna、erk1mrna和cyclind1mrna的表达情况;使用western-blot检测par-2、erk1、p-erk1、cyclind1和pcna蛋白的表达情况,并且绘制各组细胞的生长曲线。结果:1rt-pcr方法检测基因表达结果显示:(1)与空白组相比较,par-2激动组par-2mrna的表达量为2.651倍(p<0.05),par-2shrna组par-2mrna的表达量为0.385倍(p<0.05);(2)与空白组相比较,par-2激动组erk1mrna的表达量为2.580倍(p<0.05),par-2shrna组erk1mrna的表达量为0.376倍(p<0.05),mapk抑制剂组erk1mrna的表达量为0.497倍(p<0.05);(3)与空白组相比较,par-2激动组cyclind1mrna的表达量2.012倍(p<0.05),par-2shrna组cyclind1mrna的表达量为0.318倍(p<0.05),mapk抑制剂组cyclind1mrna的表达量为0.422倍(p<0.05)。2western-blot检测蛋白表达结果:(1)par-2激动组par-2蛋白的表达量为空白组的1.863倍(p<0.05),par-2shrna组par-2蛋白的表达量为空白组0.373倍(p<0.05);(2)par-2激动组p-erk1蛋白的表达量为空白组1.517倍(p<0.05),par-2shrna组p-erk1蛋白的表达量为空白组的0.478倍(p<0.05),mapk抑制剂组p-erk1蛋白的表达量为空白组的0.410倍(p<0.05);(3)par-2激动组cyclind1蛋白的表达量为空白组的1.557倍(p<0.05),par-2shrna组cyclind1蛋白的表达量为空白组的0.299倍(p<0.05),mapk抑制剂组cyclind1蛋白的表达量为空白组的0.364倍(p<0.05);(4)erk1在各组中表达无明显改变(p>0.05)。3pcan表达量结果:激动组为空白组的1.738倍(p<0.05);转染组为空白组的0.784倍(p<0.05);抑制组为空白组的0.683倍(p<0.05)。4细胞计数结果显示:与空白对照组相比较,激动组的细胞生长曲线上移,转染组、抑制组下降。结论:1在食管癌细胞ec109中,par-2与erk1及cylind1存在密切联系。2在食管癌细胞EC109中,PAR-2激动后,可以上调其下游通路中ERK1基因及p-ERK1蛋白的表达。3在食管癌细胞EC109中,PAR-2激动后可以上调其下游通路中MAPK ERK1通路,上调CyclinD1 mRNA和CyclinD1蛋白的表达,加快细胞周期,促进食管癌细胞EC109的增殖。4在食管癌细胞EC109中,PAR-2shRNA可以通过调节MAPK ERK1通路,进而调节CyclinD1的表达,进而影响食管癌细胞EC109的增殖。