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背景和目的:新城疫病毒(newcastle desease virus,NDV)属副黏病毒科Avulavirus属,为单股负链RNA病毒。NDV主要感染禽类致病,只在极少数的情况下感染人类,且为自限性疾病。通常情况下NDV对人类是无毒的,目前已作为药物治疗的一种补充和替代疗法(complementary and alternative medicine,CAM),得到广泛的研究。19世纪50年代,一位匈牙利科学家发现农场主因感染了NDV而使其所患的晚期胃癌的转移受到抑制,这个现象引起了这位科学家的关注以及众多学者对NDV的研究兴趣。随后的研究发现,NDV能选择性杀伤人类肿瘤细胞,且不依赖于肿瘤细胞增殖而独立复制,在人类肿瘤细胞中的复制效率是在正常细胞中的10 000倍,这使其成为潜在的抗癌生物因子。已有的研究结果表明,NDV溶瘤谱广且不良反应轻微,不同的NDV株系其抗肿瘤谱及抗肿瘤效果也不尽相同。近年来国外有部分NDV毒株如NDV- HUJ、NDV-73T、MTH68、PV701等已进入Ⅱ、Ⅲ期临床实验,部分实验结果显示NDV在临床肿瘤治疗方面具有良好应用前景。而国内对NDV的研究还比较少,主要集中在NDV疫苗弱毒株La Sota上。本研究小组以科室丰富的病毒来源为基础,筛选到两株特异性更强、效用更好的抗肿瘤新城疫野生毒株。本试验就这两株病毒对人结肠癌体内外的抑制作用进行了初步探讨。材料和方法:1.病毒的纯化:将新城疫病毒DK/HK/817/1980和WDK/JX/7793/2004(分别简称NDV D817、NDV 7793,均为野生毒株,由香港大学医学院微生物学系管轶教授惠赠)接种SPF级鸡胚扩增病毒,48h后收取鸡胚尿囊液。测定HA滴度≥1:2048后,用Vero-E6细胞连续3次作蚀斑纯化,得到的纯化病毒经SPF级鸡胚再次扩增后,收集保存于-80℃冰箱。2.体外实验部分:选取人结肠癌细胞LoVo、Ls174t(购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心)和人原代正常结肠细胞作为实验对象,通过蚀斑实验测定两株纯化病毒的蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU)来判断病毒的感染力;用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)微量释放法测定病毒对人结肠癌细胞和正常人结肠组织细胞的杀伤效用;用血凝实验测定病毒在不同细胞中的血凝素(hemagglutin,HA)滴度,从而判断病毒在其中的增殖力。3.体内实验部分:根据体外试验结果,选取病毒比较敏感的LoVo细胞株,以1×107个细胞/0.2mL剂量,皮下接种于裸小鼠右侧腋窝建立人结肠癌裸小鼠移植瘤模型。接种7天后明显成瘤,成功率为100%。10天后,肿瘤长、宽径分别达到5mm,去除形态、大小差异大的荷瘤小鼠,将剩余荷瘤小鼠按瘤体积配对原则随机分成8组,每组6只。分别为PBS组;5-FU组;NDV 7793和NDV D817各高、中、低三种剂量组。各组行瘤内瘤周多点少量注射,0.1mL/只,每周一次,共3周;停药后,继续观察4周。从第一次注射开始,每天观察小鼠的活动、精神状况以及移植瘤生长状况、肿瘤有无红肿、破溃。常规测量肿瘤长径、宽径以及体重,每3天1次。7周后将裸小鼠处死、解剖并取材,进行以下检测:①绘制肿瘤生长曲线,并将瘤块剥离、称重,计算肿瘤抑制率;对瘤组织进行切片、HE染色,倒置显微镜下观察病理结构。②计算荷瘤小鼠试验前后体重变化;解剖过程中观察荷瘤细胞肝脏外观,并将肝组织切片、HE染色观察肝细胞的损伤程度。③电镜下观察细胞凋亡形态;流式细胞术检测癌细胞凋亡率和坏死率;细胞质中细胞色素C(cytochromes C,Cyt-C)的检测;免疫组织化学染色观察Bax/Bcl-2蛋白表达的变化。④血凝实验检测荷瘤小鼠体内肿瘤组织及其他正常组织内NDV活病毒,以判断生物治疗的安全性。4.数据统计:实验结果采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理,用F检验比较组间差异的显著性,数据均以X表示。结果:1.体外实验结果1.1蚀斑试验中,NDV 7793出现蚀斑的时间较晚,直径较小,PFU为1.25×107,毒性较弱;D817出现蚀斑的时间较早,直径较大,PFU为5.52×107,毒性较强。1.2 NDV D817、NDV 7793对LoVo细胞株更敏感;NDV 7793对两株人结肠癌细胞的杀伤作用强于NDV D817株;且不同NDV毒株对不同癌细胞的最大杀伤效应与最佳作用时间、最适作用浓度具有相关性。1.3 NDV D817、NDV 7793均可以在肿瘤细胞中生长复制;两株病毒在人结肠癌细胞株LoVo的复制能力强于Ls 174t;NDV 7793在人结肠癌细胞的复制能力强于NDV D817。1.4 NDV D817株具有膜融合性,符合溶瘤细胞株的特性;NDV 7793株则无。符合先前研究中对NDV D817为溶瘤细胞株、NDV 7793为非溶瘤株的推断。1.5 NDV D817、NDV 7793均不能在正常人结肠细胞中的复制;且对其没有明显杀伤作用。2.体内实验结果2.1从肿瘤生长曲线图可观察到,5-FU组,NDV 7793高、中剂量组和NDV D817中剂量组荷瘤小鼠肿瘤生长较缓慢。荷瘤小鼠瘤块称重后计算肿瘤抑制率,5-FU组为37.14%(P<0.01),NDV 7793高、中剂量组和NDV D817中剂量组的肿瘤抑制率分别达到50.14%(P<0.01),37.86%(P<0.01)和47.98%(P<0.01);此外,NDV 7793抑瘤作用呈现出较好的量效关系。2.2停药后1周,可以明显观察到5-FU组较以上三组肿瘤生长更迅速。2.3实验结束后,NDV 7793高剂量组体重较PBS组高,其他各组较PBS组有不同程度的下降(P<0.05)。2.4肉眼观察各组荷瘤小鼠肝脏外观无异常,切片中无转移灶,但均有一定程度的损伤。其中5-FU的毒副作用最大,此小组有1/3荷瘤小鼠出现肝组织脂肪变性。2.5 5-FU引起癌细胞死亡方式主要是坏死;NDV 7793高剂量和NDV D817中剂量均可明显提高癌细胞的凋亡率(P<0.01)。2.6 NDV 7793高剂量和NDV D817中剂量均可明显的增强线粒体膜的通透性,提高细胞质中Cyt-C含量。2.7与5-FU组相比,NDV 7793高剂量组和NDV D817中剂量组癌细胞的Bax蛋白表达最强;而Bcl-2蛋白表达各组之间无显著差异。2.8在荷瘤小鼠体内,NDV 7793和NDV D817均可以局限在肿瘤组织中复制增殖,符合生物安全性。结论:1.本实验进一步验证了NDV7793为弱毒株,非溶瘤株;NDV D817为强毒株,溶瘤株这一结果。2. DK/HK/817/1980株NDV和WDK/JX/7793/2004株NDV均具有较强的体内外抗肿瘤效应,且最佳抑制作用和最适作用剂量相关。3. DK/HK/817/1980株NDV和WDK/JX/7793/2004株NDV的抗人结肠癌的作用机制除了可以选择性在癌细胞中复制增殖外,还可能与最适剂量的NDV毒株上调Bax、促进Cyt-C释放来增强癌细胞凋亡有关。4. NDV 7793具有较强的选择性杀伤人结肠癌的作用,且为弱毒非溶瘤病毒株,从生物治疗的安全性、有效性和毒副作用等方面考虑,这株病毒更具备肿瘤生物治疗的潜能。