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虫草花(Caterpillar fungus flowers)又名虫草菌、金虫草,是通过在培养基上接种真菌菌丝体,人工培养而来的蛹虫草子实体。蛹虫草(Cordyceps militaris)又称北冬虫夏草,是虫草属的模式种,与冬虫夏草(Cordyceps sinensis)为同属真菌,其子实体为冬虫夏草中的“草”,人工培育条件下即得虫草花。虫草花含有丰富的蛋白质、氨基酸以及虫草素、甘露醇、SOD、多糖类等成分,对人体有很好的保健功能。醇溶蛋白(Alcohol-soluble protein)是一类氨基酸组成特殊、具有独特溶解性的蛋白,被广泛应用于食品保鲜、药物覆膜、可降解材料等领域,近年来,其在抗疲劳、抗氧化、制备活性肽等方面的作用日益突显,引起人们的重视。 本试验的主要目的为: 研究虫草花醇溶蛋白的提取工艺、分离纯化条件,探讨虫草花醇溶蛋白及其分离组分的体外生理活性,以期提高人们对虫草花醇溶蛋白制备、特性与功能的认识,为日后对虫草花的进一步研究与开发利用提供理论依据。 本试验的主要内容包括: 1.以人工培养的虫草花子实体(深圳澎源生物技术公司提供)为材料,通过以乙醇为提取剂、水浴加热浸提的方法,从其体内提取醇溶蛋白。通过单因素实验,探讨乙醇浓度、pH值、提取温度、提取时间、料液比对虫草花醇溶蛋白提取效果的影响;通过正交试验设计,筛选出最优条件组合,确定虫草花醇溶蛋白提取的最佳提取工艺。 2.对提取出的虫草花醇溶蛋白粗制品进行葡聚糖凝胶层析和离子交换层析,以达到分离纯化的目的。并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳等手段对分离纯化结果进行鉴定。 3.通过紫外吸收光谱、荧光光谱等光谱分析手段,对虫草花醇溶蛋白的氨基酸构成与分子结构进行初步研究。 4.通过测定虫草花醇溶蛋白及其分离组分的还原力、对超氧阴离子自由基(O2-·)、羟自由基(·OH)、二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除作用,研究和探讨虫草花醇溶蛋白及其分离组分的体外生理活性。 本试验取得的主要研究结果有: 1.通过单因素实验,确定了各提取因素的水平,并选取乙醇浓度、pH值、提取温度、料液比等4个因素进行L9(34)正交实验,筛选出的虫草花醇溶蛋白最佳提取条件组合为:乙醇浓度55%、pH值10、提取温度50℃、料液比1:40、提取时间3h。通过此条件组合得到的虫草花醇溶蛋白提取率为19.94%(干重),提取液呈深橘黄色,有粘稠感,带有特殊的香味。经真空冷冻干燥后为黄色均匀饼状物,复溶性好。 2.虫草花醇溶蛋白样品分别经葡聚糖凝胶Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150柱层析,均得到数个蛋白峰组分,其中,将第一个小峰命名为峰Ⅰ,第二个大峰命名为峰Ⅱ。通过对峰Ⅱ组分进行DEAE-52阴离子交换柱层析,最终能得到纯的醇溶蛋白组分。 3.紫外吸收光谱和荧光光谱的结果表明,虫草花醇溶蛋白在270~280 nm范围内的紫外吸收特征并不强,在色氨酸(Trp)的特征发射波长处的荧光值不高,说明其酪氨酸(Tyr)与色氨酸(Trp)含量相对较低。其中,峰Ⅱ组分的紫外吸收值与色氨酸特征发射波长处的的荧光值均较峰Ⅰ组分略高,说明峰Ⅱ组分中的色氨酸含量可能多于峰Ⅰ组分。 4.虫草花醇溶蛋白具有一定的还原力,总蛋白的还原力明显高于峰Ⅰ及峰Ⅱ组分。此外,在对超氧阴离子自由基(O2-·)清除作用的实验中,虫草花醇溶蛋白总蛋白最大清除率为32.80%;经Sephadex G-150分离的峰Ⅰ组分最大清除率为42.95%;峰Ⅱ组分最大清除率为34.80%。在对羟自由基(·OH)清除作用的实验中,总蛋白最大清除率为41.81%;经Sephadex G-150分离的峰Ⅱ组分最大清除率为85.63%。在对二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)清除作用的实验中,总蛋白最大清除率为91.77%;经Sephadex G-150分离的峰Ⅱ组分最大清除率为37.23%。 试验结果表明,虫草花子实体中醇溶蛋白含量比玉米、小麦等谷物中的含量略低,蛋白的种类、氨基酸构成、分子量等方面也有不同。就其体外生理活性而言,虫草花醇溶蛋白及其分离组分具备一定的还原力和抗氧化性,有进一步综合开发与利用的价值。