论文部分内容阅读
目的：通过腺病毒介导TGF-β1基因转染兔骺板软骨细胞(Epiphyseal Chondrocytes，ECs)，观察TGF-β1的表达及ECs合成和分泌软骨基质的情况，为构建新型的组织工程骺板软骨提供实验依据。方法：1.利用3周龄新西兰大白兔股骨远端骺板软骨，分离出ECs并传代培养，观察ECs生长情况并鉴定。选用第3代ECs进入下一步基因转染。2.构建携带TGF-β1基因的腺病毒载体。3.分3组进行转染：分别为TGF-β1载体组、空载体组和空白组。转染后在倒置显微镜下观察各组细胞形态以及增殖情况；并在荧光显微镜下观察各组病毒转染情况，同时计算转染效率。利用MTT法检测重组腺病毒转染后的ECs增殖能力是否有明显变化。应用ELISA法检测转染后收集到的各组培养液中的TGF-β1浓度。应用Ⅱ型胶原免疫荧光评价转染后细胞的成软骨能力。采用RT-PCR检测各组细胞TGF-β1mRNA的表达情况，并用Western-blot检测各组细胞Ⅱ型胶原和TGF-β1蛋白表达情况。结果：1、成功的从兔骺板软骨中分离出ECs，并进行了传代培养及鉴定。2、在荧光显微镜下观察各组转染后细胞，发现TGF-β1载体组和空载体组有较多荧光细胞出现，而空白组始终没有出现荧光细胞，细胞转染成功。通过MTT法检测证明，腺病毒介导TGF-β1基因转染后的ECs的增殖能力短期内没有影响。3、转染14d后，TGF-β1载体组免疫荧光观察到Ⅱ型胶原较对照组明显增强。4、RT-PCR检测发现转染组标本中TGF-β1mRNA的表达较对照组明显增强。4、Western-blot结果显示转染组中CollagenⅡ和TGF-β1表达也明显增强。结论：1、本实验成功的从兔骺板软骨中分离出ECs，并进行了传代培养及鉴定，证实了第3代ECs表型稳定，骺板软骨细胞的生物学及功能学特性表达良好。2、本实验成功的构建了携带TGF-β1基因的重组腺病毒载体，并运用重组腺病毒载体成功转染ECs，且转染率高，对细胞毒性小。3、利用基因转染技术将TGF-β1基因转染至ECs，可增强ECs合成和分泌软骨基质。