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研究背景 真菌性角膜炎(fungal keratitis,FK)是一种感染性角膜病变,具有破坏性和致盲性,起病隐匿,如果不及时治疗或者误诊将会造成失明。目前研究认为,在真菌性角膜炎中,机体不同的免疫状态会影响疾病的进程。因此研究免疫应答在真菌性角膜炎中的作用可能会为疾病的治疗提供新的方法,为新药的研究提供靶点。研究表明,免疫系统在真菌性角膜炎中占有重要作用。首先,固有免疫(先天性免疫或天然免疫)被认为是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,真菌感染角膜后上皮细胞通过模式识别受体(PRRs)结合病原微生物表面的病原相关分子模式(PAMPs)进而发挥免疫防御作用。其中病原相关分子模式(PAMPs)包括C型凝集素受体(CLRs)、Tol l样受体(TLRs)和清除受体(SR)及NOD样受体(NLRs),它们可以协同激活核转录因子K B(nuclear factor κB,NF-κB)诱导炎性介质和抗菌肽的分泌,进而清除病原体。其次,特异性免疫应答(获得性免疫应答)被认为是机体免疫系统的第二道防线。在获得性免疫应答中,T细胞具有重要作用,Th1、Th2、Th17和Treg细胞之间的动态变化可能会影响真菌性角膜炎的发病进程。之前我们已证实在固有免疫中TLR2通过NF-κ B途径参与角膜抗真菌的免疫应答,因此,研究获得性免疫应答在真菌性角膜炎中的作用有重要意义。胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)是从胸腺基质细胞中发现的,与IL-17类似的短链I型细胞因子。它的发现揭示了众多过敏性疾病的发病机制和机理。目前在过敏性疾病中研究发现,上皮细胞能够分泌TSLP,高表达的TSLP通过刺激树突状细胞(DC)促使Th2型的转录因子(GATA-3)和Th2型趋化因子(TARC、MDC)表达增加,使CD4+T细胞向Th2方向分化,进而诱导Th2型获得性免疫应答,分泌细胞因子(IL-4,IL-13)。我们之前研究已证实,TSLP参与角膜抗真菌的感染的固有免疫应答。但是TSLP对真菌性角膜炎的发展过程有何作用以及如何诱导获得性免疫应答尚不清楚。目的 通过研究烟曲霉菌性角膜炎对淋巴细胞活化和TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素)表达的影响,探究TSLP在小鼠真菌性角膜炎中对获得性免疫的作用。方法1.制备烟曲霉菌菌丝悬浊液:使用购买于中国典藏培养物保藏中心的烟曲霉菌菌株(aspergillus fumigatus,AF)CCTCC93024,并接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基中,充分混匀并培养24小时。2.建造小鼠烟曲霉菌性角膜炎模型,划伤角膜,接种烟曲霉菌菌丝悬液并缝合眼睑24小时,裂隙灯观察不同时间点小鼠角膜感染的情况。3.使用显微注射针在烟曲霉菌感染前24小时和4小时结膜下分别注射TSLPsiRNA,对照siRNA,人重组TSLP蛋白和IgG,每眼每次各5ul。观察到第5天和第七天的小鼠于感染后第三天再次注射TSLPsiRNA,对照siRNA,人重组TSLP蛋白和IgG。4.将实验动物分成七组:空白对照组、PBS组、AF组、TSLPsiRNA+AF组、对照siRNA+AF组、人重组TSLP+AF组和IgG+AF组,裂隙灯拍照并进行临床评分。HE染色观察病理改变,并分别留取七组相同时间点的角膜组织,行RT-PCR、ELISA检测TSLP,Th1细胞因子(IFN-γ),Th2细胞因子(IL-4、IL-13),Th17细胞因子(IL-17A、IL-17F),Treg 细胞因子(TGF-β),Th1 型转录因子(T-bet),Th2型转录因子(GATA-3),Th17转录因子(STAT-3)和Treg转录因子(Foxp3)的表达。结果 小鼠角膜感染烟曲霉菌后可以观察到在24小时出现明显的角膜浸润,在72小时发现严重的角膜溃疡,并于第7天形成角膜瘢痕而愈合。HE结果显示在感染后24h到72h大量炎症细胞浸润,基质水肿。取小鼠角膜组织,行RT-PCR、ELISA检测,结果示:与对照组和PBS组相比,AF组中TSLP于第一天出现高峰,随后几天逐渐下降,于第五天出现增高趋势(在统计学上有显著性差异);Th2细胞分泌细胞因子(IL-4,IL-13)和Th17细胞因子(IL-17A、IL-17F)在第五天表达量最高(差异有统计学意义);IFN-γ、T-bet、GATA-3、STAT-3的表达在感染后24小时表达量最高(差异有统计学意义);Treg细胞因子(TGF-β)和转录因子(FoxP3)的表达无明显变化。TSLPsiRNA+AF组、对照siRNA+AF组、人重组TSLP+AF组、IgG+AF组与AF组相比,IL-4、IL-13、GATA-3的表达量在TSLPsiRNA+AF组减少,在人重组TSLP+AF组增加(差异有统计学意义);IFN-γ、IL-17A、IL-17F、T-bet、STAT-3的表达量无明显变化(差异无统计学意义)。结论 小鼠角膜感染烟曲霉菌后,TSLP表达增加。TSLP能够诱导Th2型的免疫应答,促进CD4+T细胞向Th2方向分化,分泌Th2型细胞因子。感染烟曲霉菌后出现Th1与Th2、Th17比例失衡,但对Treg表达无影响。TSLP联结角膜抗真菌感染的固有免疫与获得性免疫。这可能为真菌性角膜炎的临床治疗提供理论依据,为新药的研制提供靶点。