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研究背景糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病（diabetic mellitus,DM）最常见的并发症之一,同时也是导致终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）的主要原因,主要表现为蛋白尿、高血压和进行性肾功能下降。随着病情的进展,患者还会出现视网膜、心脏、神经等多器官严重并发症,目前还没有明确的治疗方法。肾小球上皮细胞,也称为足细胞,是一种终末分化细胞,是肾小球中重要的功能细胞。据研究报道,足细胞的损伤和丢失是导致糖尿病肾病进展的关键因素,会导致肾小球滤过屏障功能的下降,进而加速糖尿病肾病进程。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一种缺乏蛋白质编码能力,长度超过200个核苷酸的非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA）,在许多生物过程中都是必不可少的,如染色质修饰、转录调控、转录后调控、细胞增殖、分化和凋亡等。尽管越来越多的lncRNA正在被发现和研究,但它们在糖尿病肾病等疾病中的作用和潜在的作用机制仍不清楚。我们前期工作发现lncRNAENSG00000254561.4在糖尿病肾病中表达变化明显。因此,本研究利用糖尿病肾病患者样本和人足细胞,验证lncRNA ENSG00000254561.4表达变化及其临床意义,探讨lncRNAENSG00000254561.4在高糖诱导的足细胞损伤中的作用及机制,这将为糖尿病肾病的诊断和临床治疗提供新的靶点。第一部分明确lncRNA ENSG00000254561.4在糖尿病肾病患者中的表达水平及其临床意义目的:明确lncRNA ENSG00000254561.4在糖尿病肾病患者中的表达情况,探讨lncRNA ENSG00000254561.4表达与患者临床指标的相关性。方法:1、收取非糖尿病肾病患者手术切除的癌旁正常肾组织和经肾穿刺活检确诊的糖尿病肾病患者的肾组织。①过碘酸雪夫染色 PAS（periodic acid-schiff stain,PAS）、HE 染色、Masson 染色评估糖尿病肾病患者肾组织病理变化。②透射电镜（transmission electron microscope,TEM）观察肾组织病理改变和足细胞形态结构改变。③免疫荧光（immunofluorescence,IF）及 RNA-荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）实验共同检测lncRNA ENSG00000254561.4在肾组织和足细胞中的表达和分布。2、收取对照组和糖尿病肾病组患者血液样本,离心后收集血浆,-80℃保存。对照组样本来源于山东省立医院健康体检中心,糖尿病肾病组样本来源于山东省立医院肾内科。①Real-time PCR检测lncRNAENSG00000254561.4在血浆中的表达水平。②统计学方法分析患者血浆lncRNAENSG00000254561.4的表达水平与患者年龄、性别、血肌酐、血尿素氮、肾小球滤过率、血脂、尿白蛋白肌酐比等临床指标的相关性。结果:1、PAS染色、HE染色和Masson染色发现糖尿病肾病组患者肾小球基底膜弥漫性增厚,系膜细胞和基质增生,肾小球出现不同程度的硬化和纤维化;透射电镜结果显示足细胞足突融合或足细胞缺失,肾小球基底膜增厚伴系膜基质增多。2.、FISH联合免疫荧光染色显示,lncRNA ENSG00000254561.4与podocin存在染色重叠,同时与对照组相比,糖尿病肾病患者肾组织和足细胞中lncRNA ENSG00000254561.4表达明显降低。3、Real-time PCR结果显示,与对照组相比,lncRNA ENSG00000254561.4在糖尿病肾病患者的血浆中表达明显降低。Spearman’s相关性分析表明lncRNA ENSG00000254561.4表达水平与胱抑素、血肌酐和尿白蛋白肌酐比呈负相关,与肾小球滤过率呈正相关。结论:LncRNAENSG00000254561.4在糖尿病肾病患者肾组织和血浆中表达下降,且与胱抑素、血肌酐、肾小球滤过率和尿白蛋白肌酐比水平具有相关性,提示lncRNA ENSG00000254561.4参与糖尿病肾病的发生发展并发挥重要作用。第二部分明确lncRNAENSG00000254561.4在高糖诱导的足细胞损伤中的作用及机制目的:探讨lncRNA ENSG00000254561.4在人足细胞中的表达水平,明确lncRNA ENSG00000254561.4在高糖诱导的足细胞损伤中的作用及机制。方法:1、分别用低糖,高糖和高渗培养基培养足细胞48h。①RNA-FISH 实验检测 lncRNAENSG00000254561.4 表达和定位。②Real-time PCR检测RNA表达水平。2、构建特异性的lncRNAENSG00000254561.4过表达质粒,将足细胞分为:LG组（低糖刺激）、HG组（高糖刺激）、HG+OE-NC组（高糖刺激+空载质粒）和HG+OE-254561.4 组（高糖刺激+lncRNAENSG00000254561.4 过表达质粒）。①Real-time PCR 检测lncRNAENSG00000254561.4 过表达效率。②Western Blot、Real-time PCR 和免疫荧光检测 ZO-1、Desmin、Drp1、MFN2 的表达变化。③鬼笔环肽-FITC染色观察足细胞骨架改变。④Transwell实验检测足细胞迁移能力改变。⑤MitoSOX Red染色观察足细胞线粒体ROS表达变化。⑥Mito-Tracker Red染色观察线粒体形态变化。3、构建特异性的lncRNAENSG00000254561.4敲低质粒,将足细胞分为:LG组（低糖刺激）、HG组（高糖刺激）、LG+sh-NC组（低糖刺激+空载质粒）和LG+sh-254561.4组（低糖刺激+lncRNAENSG00000254561.4敲低质粒）。①Real-time PCR 检测 lncRNAENSG00000254561.4 敲低效率。②Western Blot、Real-time PCR 和免疫荧光检测 ZO-1、Desmin、Drp1、MFN2 的表达变化③鬼笔环肽-FITC染色观察足细胞骨架改变。④Transwell实验检测足细胞迁移能力改变。⑤MitoSOX Red染色观察足细胞线粒体ROS表达变化。⑥Mito-Tracker Red染色观察线粒体形态变化。结果:1、Real-time PCR 显示高糖刺激 48h 后,lncRNA ENSG00000254561.4 在足细胞表达明显下调,RNA-FISH染色显示lncRNAENSG00000254561.4在足细胞胞质和胞核内均有分布,以胞核为主。2、Western Blot、Real-time PCR和免疫荧光结果显示,与低糖组相比,高糖组ZO-1、MFN2表达下调,Desmin、Drp1表达上调;鬼笔环肽-FITC染色发现足细胞骨架断裂增多并向细胞边缘集中,Transwell实验显示足细胞迁移能力增强,同时MitoSOXRed染色观察到足细胞线粒体ROS表达增多,Mito-Tracker Red染色发现线粒体形态多为点状。而与高糖组相比,过表达lncRNAENSG00000254561.4可以使ZO-1、MFN2表达上调,Desmin、Drp1表达下调,足细胞骨架断裂减少且分布均匀,足细胞迁移能力下降,同时足细胞线粒体ROS表达降低,线粒体形态正常多为网状。3、Western Blot、Real-time PCR和免疫荧光结果显示,与低糖组相比,敲低lncRNA ENSG00000254561.4 后,ZO-1、MFN2 表达下调,Desmin、Drp1表达上调;鬼笔环肽-FITC染色显示足细胞骨架断裂明显增多并发生骨架重排,Transwell实验提示足细胞迁移能力增强,同时足细胞线粒体ROS表达增多,线粒体形态多为点状。结论:本研究发现lncRNA ENSG00000254561.4在高糖诱导的足细胞中表达下调,lncRNA ENSG00000254561.4可通过调控线粒体损伤参与高糖诱导的足细胞细胞骨架重排及损伤,为寻找治疗和预防糖尿病肾病的新靶点提供了实验基础。