论文部分内容阅读
宫颈癌是全球女性最为常见的恶性肿瘤之一,其发生率近年来在年轻女性中呈现稳步上升趋势,且多发生在社会经济发展较为落后的国家和地区,尤其是发展中国家影响女性健康的主要问题。据统计,全世界每年大约有274,000女性死于宫颈癌。大量研究显示,高危型人乳头瘤状病毒(HPV)感染是导致女性宫颈癌发生、发展的必要而非充分的条件,而且HPV16和18型对宫颈癌的形成占主要地位。近年来,HPV表观遗传学因素与宫颈细胞癌变间的关系越来越受到关注,其在宫颈癌变进程中的作用研究已经起步,研究主要集中在HPV16和HPV18两型的DNA甲基化改变,HPV16 DNA甲基化研究较多的靶区是L2、L1、LCR和E5/E6/E7,但是,截至目前对于HPV区域CpG位点甲基化改变及其致病作用机制尚不清楚,因此研究结论尚不统一,观点存在较大争议。多数研究认为L1的甲基化程度与宫颈病变进展有一定相关性,认为HPV L1区域甲基化模式的改变有可能成为预测宫颈癌及癌前病变进展的潜在诊断指标。2011年HPV mRNA检测方法—Aptima(?) HPV Assay,已经被FDA认证,开始在临床上应用,但目前的研究中,HPV E6/E7 mRNA与HPV DNA的临床指导价值研究较多,很少研究对比E6/E7 mRNA与HPV DNA甲基化在筛查HPV阳性病人中的意义。本研究采用甲基化敏感性高分辨溶解曲线(Methylation-sensitive High Resolution Melting,MS-HRM)和QUANTIVIRUS@HPV E6/E7 mRNA 3.0 Assay (b-DNA)法来分别检测单一HPV16阳性病人HPV16 L1基因甲基化程度和HPVE6/E7 mRNA水平,并评估这两种方法在诊断宫颈上皮内病变中的临床价值。方法1.收集2012年2月-2013年5月期间,在郑州大学第三附属医院进行常规宫颈新柏氏液基细胞学(TCT)检测的标本947例(年龄17-76岁,中位年龄35岁)。HPV分型采用反向杂交PCR技术,仅单一HPV16阳性被纳入本研究,最终追踪到具有组织学检测结果的患者共114例,其中17例宫颈病变阴性或慢性炎症者为对照组,CIN1 25例,CIN2 29例,CIN3 32例,SCC 11例。所有纳入研究的114例患者年龄25-76岁,中位年龄37岁。本研究通过了郑州大学第三附属医院生命科学伦理委员会的批准。2.从genebank中查找所要检测的HPV16 L1序列,并运用Primer Premier 5.0软件根据修饰后的此段序列设计引物。根据目标序列合成100%和0%DNA甲基化标准品,并用两个标准品配置0%、1%、10%、25%、50%、75%和100%共7个甲基化DNA浓度,作为MS-HRM的标准品。3.提取和纯化剩余TCT标本中DNA,对100%甲基化标准品和提取的DNA进行重亚硫酸盐修饰,采用甲基化敏感性高分辨溶解曲线法检测标本HPV16 L1基因甲基化程度。4.处理剩余TCT标本,采用QUANTIVIRUS@HPV E6/E7 mRNA 3.0 Assay (b-DNA)法检测标本中HPV E6/E7 mRNA水平。统计分析使用SPSS 17.0软件来进行数据统计分析。HPV16 L1 DNA甲基化程度和E6/E7mRNA水平与宫颈病变严重程度间关系采用Spearman秩相关分析：组间比较采用非参数检验：不同检验方法间敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值比较采用χ2检验。两种检测方法间一致性评估采用Kappa统计分析。α=0.05为检验水准。结果1.对照组、CIN1、CIN2、CIN3和SCC中HPV16 L1甲基化阳性率分别为5.9%、64.0%、86.2%、93.8%和100.0%。HPV16 L1甲基化程度随组织学诊断级别的增高而增加(rs=0.661,P<0.001)。CIN2+(包括对照和CIN1)组HPV16 L1甲基化程度明显高于CIN2-(包括CIN2、CIN3口SCC)组(P<0.001)。2.全部114例标本中,81例标本的E6/E7 mRNA被成功检测。E6/E7 mRNA水平随组织学诊断级别的增高而增高(r,=0.477,P<0.001)。对照组、CIN1、CIN2、CIN3和SCC中E6/E7 mRNA水平分别为50.0%,81.3%,93.8%,100.0%和100.0%。CIN2+组E6/E7 mRNA水平明显高于CIN2-组(P<0.001)。HPV E6/E7 mRNA阳性率(85.2%)高于HPV16 L1甲基化阳性率(72.8%,χ2=4.221,P<0.001)。HPV16 L1甲基化程度与E6/E7 mRNA表达水平呈正相关(rs=0.313,P<0.05)。3.以组织学为金标准,HPV16 L1甲基化分别与联合检测、E6/E7 mRNA检测方法间敏感性、阳性预测值和阴性预测值比较均无统计学差异(均P>0.05)；HPV16 L1甲基化方法和两者联合检测方法的特异性高于E6/E7 mRNA方法(均P<0.05);两者联合检测方法的特异性高于HPV16 L1甲基化方法,但从数值上比较没有统计学差异(P>0.05)。结论1.HPV16 L1甲基化程度和E6/E7 mRNA水平均随宫颈病变严重程度的增加而增加。2.HPV16 L1基因甲基化检测方法和E6/E7 mRNA检测方法均有望作为进一步分流单-HPV16阳性病人的方法。3.HPV16 L1甲基化方法与HPV E6/E7 mRNA方法相比,在较少假阳性率方面,更具优势。二种方法联合则对特异性有较大提高,在分流单一HPV16感染患者方面,应具有非常好的临床应用前景。