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第二部分DcR3在人胰腺癌中的表达及其与临床病理参数间关系目的研究胰腺癌中DcR3的蛋白表达与临床病理参数间关系。方法通过免疫组织化学(IHC)检测人胰腺癌组织芯片中DcR3蛋白的表达,91例胰腺癌组织,5例正常胰腺组织,比较其表达差异,并在胰腺癌癌组织中分析其表达与主要临床参数相关性。结果DcR3蛋白在细胞内主要分布于胞浆中,在胰腺癌中DcR3蛋白阳性表达率明显高于正常胰腺组织,且DcR3阳性表达与肿瘤TNN分期相关。分期越晚,其表达越高。结论：胰腺癌组织中存在DcR3基因的过表达,DcR3的表达与肿瘤TNM分期相关。第二部分莪术溃坚方对胰腺癌MiaPaCa-2裸鼠移植瘤的抑瘤作用研究目的在动物体内观察莪术溃坚方对人胰腺癌的抑瘤作用,为莪术溃坚方应用于临床治疗胰腺癌,改善预后提供一定的理论依据。方法利用Real time PCR筛选出高表达DcR3的胰腺癌细胞系MiaPaCa-2,建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤,分成模型组、卡培他滨组、莪术溃坚方低剂量组(10g/Kg)和莪术溃坚方高剂量组(20g/Kg)干预治疗,观察肿瘤生长情况,比较不同组间抑瘤率,通过Western blot方法检测不同组裸鼠肿瘤的DcR3蛋白的表达。结果DcR3在四种人胰腺癌细胞中均有表达,其中AsPC-1、MiaPaca-2和BxPC3细胞中DcR3表达量是PANC-1细胞的0.8,8.5和3.2倍；成功建立了MiaPaCa-2胰腺癌荷瘤裸鼠模型,与模型组相比,卡培他滨组、莪术溃坚方低剂量组(10g/Kg)及莪术溃坚方高剂量(20g/Kg)对MiaPaCa-2体内生长有一定抑制作用,卡培他滨组、莪术溃坚方低剂量组(1Og/Kg)及莪术溃坚方高剂量(20g/Kg)的肿瘤体积在造模后第3周、第4周时明显小于模型组(P<0.05)。卡培他滨组、莪术溃坚方低剂量组(10g/Kg)及莪术溃坚方高剂量(20g/Kg)的肿瘤体积在造模后第1-4周无明显差别(P>0.05)；与模型组相比,卡培他滨组的DcR3蛋白相对表达量无明显差异(P>0.05),莪术溃坚方低剂量组组(10g/Kg)及莪术溃坚方高剂量组(20g/Kg)均明显低于模型组(P<0.05)。结论莪术溃坚方可以通过抑制移植瘤内的DcR3的表达,抑制肿瘤生长,达到治疗作用。低剂量莪术溃坚方和高剂量莪术溃坚方抑瘤率无明显差别。第三部分莪术溃坚方下调DcR3抑制人胰腺癌细胞的生长目的：研究莪术溃坚方对人胰腺癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭和凋亡影响和可能机制。方法通过MTT法检测莪术溃坚方单药中主要单体莪术醇、呋哺二烯、吉马酮、苦杏仁苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对Miapaca-2、BxPC-3对人胰腺癌细胞体外增殖影响,并绘制细胞增殖曲线；选取抑制肿瘤细胞最明显的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d,通过划痕实验、体外侵袭实验、AnnexinV-FITC/PI双染色法检测其对MiaPaCa-2细胞侵袭、凋亡的影响；体外设计针对DcR3基因的siRNA1、 siRNA2、siRNA3和contol siRNA,采用脂质体转染方法将siRNA导入人胰腺癌细胞系miapaca-2,通过Western blot方法对细胞RNAi后DcR3表达情况进行鉴定,测定经DcR3的RNAi后,柴胡皂苷a和d对凋亡敏感性影响。Western blot检测检测加入柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、U0126(ERK1/2抑制剂)后DcR3表达,以及MAPK信号通路下游反应性靶基因ERK1/2及p-ERK1/2。结果莪术溃坚方中单体莪术醇、呋喃二烯、吉马酮、苦杏仁苷对人胰腺癌细胞系MiaPaca-2和BxPC3有生长抑制作用不明显；柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对人胰腺癌细胞系MiaPaca-2和BxPC3有明显生长抑制作用(P<0.05),其抗肿瘤作用呈时间及剂量依赖性,用药72h后效应明显；在柴胡皂苷a或柴胡皂苷d作用24h后,MiaPaCa-2细胞体外运动能力都明显减弱。与未做任何处理的MiaPaCa-2细胞相比,经柴胡皂苷a作用24h后,伤口面积降低了61.2%(P<0.05);经柴胡皂苷d作用24h后,伤口面积降低了47.3%(P<0.05)。在柴胡皂苷a或柴胡皂苷d作用48h后,MiaPaCa-2细胞体外侵袭能力明显减弱,经柴胡皂苷a作用48小时后,侵袭细胞减少了26.5(P<0.05)；经柴胡皂苷d作用48小时后,侵袭细胞数减少了31.2%(P<0.05)。柴胡皂苷a体外给药24h,可导致MiaPaCa-2胰腺癌细胞凋亡显著增加；柴胡皂苷d体外给药24h,可导致MiaPaCa-2胰腺癌细胞凋亡显著增加；经DcR3RNAi后,可明显增加对柴胡皂苷a、柴胡皂苷a对诱导MiaPaCa-2胰腺癌细胞凋亡能力。经柴胡皂苷a、柴胡皂苷d和U0126(20umm)作用48小时后, MiaPaCa-2细胞DcR3蛋白表达水平明显降低,ERK1/2蛋白无明显变化,p-ERK1/2表达随之降低。结论：莪术溃坚方中柴胡皂苷a、d对胰腺肿瘤抑瘤效果明显,且随时间、剂量关系成正比,进一步实验表明了柴胡皂苷a和d还可以抑制胰腺肿瘤细胞迁移和增殖能力,且可以促进胰腺肿瘤细胞的凋亡。其作用机制可能在于通过抑制MAPK信号通路,抑制了p-ERK激活,从而减少了DcR3的表达,从而促进肿瘤细胞的凋亡,抑制了肿瘤细胞增殖和迁移侵袭能力。