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中枢炎症是多种中枢神经系统(Central nervous system,CNS)疾病共同的病理生理通路,可导致突触损伤、神经元结构功能丧失和CNS疾病恶化。脑内胶质细胞的过度激活、促炎因子的过度释放以及血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)的损伤是中枢炎症的重要特征。尽管中枢炎症相关性疾病具有完全不同的临床表现,但是机体蛋白质稳态的丧失是其共有的分子病理改变。内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是细胞合成、折叠、加工蛋白质的主要场所。一些生理或病理因素均会干扰内质网正常蛋白折叠过程,导致未折叠蛋白或者错误折叠蛋白在ER内聚集,称为内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS),继而启动未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)。既往认为ERS是导致CNS病变的因素之一,但是近期有学者提出了“轻度ERS”的概念,即非损伤性、温和的ERS。轻度ERS未激活UPR下游促凋亡蛋白,只引起UPR上游信号通路分子的活化,因而具有迥然不同的病理生理效应。已有研究报道轻度ERS在脑缺血、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等多种CNS疾病中发挥保护作用。因此,ERS对CNS疾病的作用是复杂的、非线性的,其与中枢炎症的关系值得深入研究。为此,本研究将围绕中枢炎症的关键环节(小胶质细胞、星形胶质细胞激活以及BBB损伤),系统探讨轻度ERS对中枢炎症的影响及其可能机制。本研究不仅有助于阐明ERS在中枢炎症中的作用,也将为临床治疗中枢炎症相关性疾病提供潜在的新策略。第一部分轻度内质网应激对小胶质细胞的调控及其在中枢炎症中的作用研究目的:以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)为炎症诱导因子,探讨轻度ERS对小胶质细胞激活的影响及其在中枢炎症中的作用。研究方法:(1)在体实验实验一:将ERS激活剂衣霉素(Tunicamycin,TM)溶解于10%的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中,按以下三种剂量定向注射入SD大鼠侧脑室(0.3μg/2μL、3μg/2μL和30μg/2μL)。成年SD大鼠随机分为五组:(1)正常组:不做任何处理;(2)溶剂组:侧脑室注射等体积药物溶剂;(3)低剂量TM组:侧脑室给予TM 0.3μg;(4)中剂量TM组:侧脑室给予TM 3μg;(5)高剂量TM组:侧脑室给予TM 30μg。注射药物24小时后,检测各组大鼠海马区细胞凋亡和ERS的激活水平。实验二:将LPS和ERS抑制剂4-苯基丁酸钠盐(Sodium 4-phenylbutyrate,4-PBA)溶解于生理盐水中。成年SD大鼠随机分为五组:(1)正常组:不做任何处理;(2)溶剂组:侧脑室和腹腔注射等体积药物溶剂;(3)LPS注射组(LPS组):侧脑室和腹腔注射等体积药物溶剂,1小时后腹腔注射LPS 500μg/kg;(4)TM预处理组(TM+LPS组):侧脑室给予TM 3μg,1小时后腹腔注射LPS 500μg/kg;(5)TM加4-PBA预处理组(TM+4-PBA+LPS组):侧脑室给予TM 3μg后立即腹腔注射4-PBA 100mg/kg,1小时后腹腔给予LPS 500μg/kg。注射LPS后24小时,检测各组大鼠海马区炎症因子含量,小胶质细胞活化和ERS的激活水平。(2)离体实验实验一:用不同浓度的TM(0.5、5、50 ng/m L)处理原代小胶质细胞,24小时后检测小胶质细胞中ERS激活水平。实验二:单纯采用5 ng/m L TM,或TM加4-PBA处理原代小胶质细胞,1小时后加入LPS(10 ng/m L),24小时后检测小胶质细胞活化水平和分型情况、炎症因子释放量以及ERS激活水平。研究结果:(1)在体实验实验一:侧脑室定向注射低剂量TM(0.3和3μg)可以诱导大鼠海马区产生轻度、非损伤性的ERS。实验二:与正常组相比,腹腔注射LPS激活大鼠海马区M1型小胶质细胞,增加炎症因子的表达及细胞凋亡水平。与LPS组相比,预先侧脑室注射TM 3μg可减轻LPS导致的大鼠海马区细胞凋亡,缓解M1型小胶质细胞过度激活和降低炎症因子水平。与TM+LPS组相比,腹腔注射4-PBA通过抑制ERS,拮抗了TM(3μg)对LPS处理后大鼠的神经保护作用。(2)离体实验实验一:低浓度TM(0.5和5 ng/m L)可以诱导原代小胶质细胞产生轻度、非损伤性ERS,同时不具有细胞毒性。实验二:预先给予5 ng/m L TM可以抑制LPS导致的M1型小胶质细胞的激活及炎症因子的释放,促进细胞向M2a型转化。4-PBA可通过抑制原代小胶质细胞中的ERS,抵消5 ng/m L TM的保护作用。研究结论:(1)低剂量TM可以诱导大鼠海马区产生轻度ERS,且不引起细胞凋亡。(2)低浓度TM可以诱导原代小胶质细胞产生轻度ERS,同时不影响细胞活性。(3)轻度ERS可以使M1/2b型小胶质细胞向M2a型转化,减少炎症因子释放,减轻中枢炎症。第二部分轻度内质网应激对星形胶质细胞的调控及其在中枢炎症中的作用研究目的:探讨轻度ERS对星形胶质细胞的调控及其在LPS诱导的中枢炎症中的作用。研究方法:(1)在体实验成年SD大鼠随机分为五组:(1)正常组:不做任何处理;(2)溶剂组:侧脑室和腹腔注射等体积药物溶剂;(3)LPS注射组(LPS组):侧脑室和腹腔注射等体积药物溶剂,1小时后腹腔注射LPS 500μg/kg;(4)TM预处理组(TM+LPS组):侧脑室给予TM 3μg,1小时后腹腔注射LPS 500μg/kg;(5)TM加4-PBA预处理组(TM+4-PBA+LPS组):侧脑室给予TM 3μg后立即腹腔注射4-PBA 100mg/kg,1小时后腹腔给予LPS 500μg/kg。LPS处理24小时后,检测大鼠海马区星形胶质细胞活化水平,细胞炎症因子的释放量以及ERS激活水平。(2)离体实验实验一:用不同浓度的TM(0.1、1、10 ng/m L)处理原代星形胶质细胞,24小时后检测星形胶质细胞中ERS激活水平。实验二:单纯采用1 ng/m L TM,或TM加4-PBA处理原代星形胶质细胞,1小时后加入LPS(100 ng/m L),24小时后检测星形胶质细胞活化情况、细胞炎症因子释放量以及ERS激活水平。研究结果:(1)在体实验与正常组相比,腹腔注射LPS可过度激活大鼠海马区星形胶质细胞。与LPS组相比,预先侧脑室注射3μg TM可以缓解LPS导致的星形胶质细胞过度激活。与LPS+TM组相比,腹腔注射4-PBA通过抑制轻度ERS,拮抗了TM减轻星形胶质细胞过度激活的作用。(2)离体实验实验一:低浓度TM(0.1和1 ng/m L)可以诱导原代星形胶质细胞产生非损伤性、轻度ERS,同时不具有细胞毒性。实验二:LPS可以激活星形胶质细胞,促进星形胶质细胞分泌炎症因子。预先给予1 ng/m L TM可以抑制LPS导致的星形胶质细胞过度激活及炎症因子的释放。若同时加入4-PBA抑制ERS,1 ng/m L TM对星形胶质细胞激活的抑制作用则消失。研究结论:(1)低浓度TM可以诱导星形胶质细胞产生轻度ERS,而不损伤细胞活性。(2)轻度ERS可以缓解LPS导致的星形胶质细胞过度活化,减少星形胶质细胞分泌过多炎症因子,减轻中枢炎症。第三部分轻度内质网应激对血脑屏障的调控及其在中枢炎症中的作用研究目的:探讨轻度ERS预处理是否可以缓解LPS导致的BBB损伤。研究方法:成年SD大鼠随机分为五组:(1)正常组:不做任何处理;(2)溶剂组:侧脑室和腹腔注射等体积药物溶剂;(3)LPS注射组(LPS组):侧脑室和腹腔注射等体积药物溶剂后1小时,腹腔注射LPS 500μg/kg;(4)TM预处理组(TM+LPS组):侧脑室给予TM 3μg后1小时,腹腔注射LPS 500μg/kg;(5)TM加4-PBA预处理组(TM+4-PBA+LPS组):侧脑室给予TM 3μg后立即腹腔注射4-PBA 100mg/kg,1小时后腹腔给予LPS 500μg/kg。LPS处理24小时后,检测BBB通透性的变化。研究结果:与正常组相比,LPS组大鼠海马区白蛋白和伊文思蓝(Evans blue,EB)含量明显增多。与LPS组相比,提前侧脑室注射3μg TM则可抑制EB和白蛋白的渗出。与正常组相比,LPS组大鼠海马区紧密连接蛋白occludin和claudin-5的表达量明显升高、金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达量明显下调。提前侧脑室注射3μg TM则可明显减轻上述变化。与TM+LPS组相比,4-PBA在抑制ERS的同时,也抵消了3μg TM对BBB的保护作用。研究结论:轻度ERS可以缓解LPS导致的BBB破坏。