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原发性肝癌(primary hepatic cailcer,PHC),简称肝癌,系原发于肝细胞和/或肝内胆管细胞的恶性肿瘤,包括肝细胞癌、肝管细胞癌和混合癌。具有发现晚、发展快、治疗难、预后差的特点,发病率呈逐年上升趋势,是严重危害人类健康的一种疾病。是世界上发病率最高的10种肿瘤之一,占全世界每年新发现恶性肿瘤的4﹪,我国肝癌病例数约占全世界肝癌总例数的43.7﹪。就死亡率而言,肝癌在全球男性恶性肿瘤中居第7位,女性中居第9位。我国肝癌死亡率居恶性肿瘤死亡率的第2位,仅次于胃癌。由于肝癌的发病机制不明确,目前缺乏针对此病的特异性治疗。现代医学采用外科手术、化疗、放疗、介入治疗等综合治疗,其总体疗效并不乐观,其发病率及死亡率有逐步升高的趋势。
中医学文献中,虽然无肝癌的病名,但相似的症状和体征记载十分丰富,多属于中医学“积聚”、“癥瘕”、“黄疸”、“臌胀”、“胁痛”等范畴。一般认为,本病的发生是由于正气不足,脏腑功能失调,气滞、血瘀、痰凝、毒聚而形成的。肝癌的病因病机总的来说是本虚标实,以脾虚为本,气滞、血瘀、湿热、毒邪为标。
导师陈泽雄副教授依据中医对肝癌“正虚邪实”、“本虚标实”这一发病机制的根本认识,认为邪正关系始终是肝癌发生和发展的关键,故“扶正祛邪”是治疗肝癌的根本大法。莪莲柴胡汤是导师对肝癌中医临床治疗经验的总结,具有健脾疏肝、解毒散结的功效。既往导师陈泽雄和师兄胡洪涛应用本方的临床和基础研究证明其对中晚期肝癌或体外癌细胞具有一定的治疗作用,可改善临床症状,提高生活质量,抑制端粒酶活性等作用。因此,在活体中进一步探讨本方的抗癌作用机制,阐明其药理活性意义重大。研究目的研究莪莲柴胡汤对间接原位移植雄性裸鼠肝癌模型的抗癌作用。
1、探讨运用人类肝细胞肝癌细胞株行间接“原位移植雄性裸鼠肝癌模型”的建立。
2、分析莪莲柴胡汤对该模型解剖及生存情况的影响。
3、分析莪莲柴胡汤对该模型肝组织、肝癌旁组织、肝癌组织PTEN蛋白阳性表达的影响及其在3种组织中的表达强度。
材料
1、造模材料人肝细胞癌细胞株Bel-7402;BALB/c裸鼠,雄性,4~6周龄,60只。
2、干预材料莪莲柴胡汤浓缩剂;FT207注射液(替加氟注射液)。
3、试剂兔抗人PTEN多克隆抗体、二步法免疫组化检测试剂。
实验方法
1、造模采用Bel-7402人肝癌细胞株复制裸鼠“间接肝原位移植瘤模型”。
2、干预裸鼠在无特殊病原菌(SPF)条件下分笼饲养。将裸鼠随机分为5组,造模裸鼠4组(中药高、中、低浓度组和FT-207化疗组),每组各12只,4组模型鼠术后即进入实验。口服给药,0.2ml药液/10g体重,每天一次,连续4周。第5组不造模,与0.2ml生理盐水/10g体重灌服,作解剖对照。
3、处理观察过程中,记录瘤鼠的生存时间。治疗结束,裸鼠眼球采血后处死解剖,记录瘤体积、瘤指数(瘤重/体重)、肝指数(肝重/体重)、脾指数(脾重/体重),并将正常肝组织、癌旁组织和癌组织标本用4﹪中性甲醛溶液固定,送病理石蜡包埋切片。
4、病理检测组织学检测,用常规苏木精-伊红染色(HE);免疫组化检测,采用二步法免疫组化检测方法检测PTEN蛋白表达;染色结果评估,采用Bresalier半定量公式判断染色结果;读片,双人双盲阅片,共2次,分别计算IS,取2次的平均数作为结果。
5、统计学分析:计量正态资料用“x±s”表示,非正态计量资料用“中位数(极值)”表示,计数资料用“部分/总体”,资料采用SPSS 14.0统计软件计量资料进行T检验、方差分析、秩和检验、计数资料采用卡方检验、秩和检验。
结果
1、解剖证实造模成功率48/48;实验结束获得有效病理标本48例。成瘤以单发巨块型为主,部分伴肝内和/或肺内多发转移,符合人类肝癌解剖特点。
2、牛存情况分析:治疗组生存时间均长于化疗组,p<0.05或0.01。
3、体重变化分析:结果说明中药可能在保持瘤鼠体重,减轻肿瘤对机体的消耗、控制恶液质的进展比替加氟有效,p<0.05。
4、解剖情况分析:中药治疗与替加氟治疗比较不能减小瘤体积,p>0.05;但在抑制肝脾肿大上中药治疗优于FT-207治疗,p<0.05,且以高浓度组效果最好,p<0.01;治疗组瘤鼠肝内转移少于对照组,p<0.05。
5、抑癌基因PTEN表达分析:结果说明瘤鼠肝脏PTEN蛋白表达强度癌旁组织最高,癌组织最低,正常肝组织次之,p<0.05。中药治疗该肝癌动物模型与替加氟对比,可以明显提高抑癌基因PTEN的表达,p<0.05。
结论
1、本研究所采用肝癌动物模型是研究肝癌治疗较为理想的实验动物模型。
2、中高浓度(0.5g生药/kg体重和1.0g生药/kg体重)莪莲柴胡汤可以延长Bel-7402间接原位移植肝癌裸鼠模型的生存时间,提高生存率。
3、不同浓度莪莲柴胡汤能够控制该模型体重减轻,提高生存质量;能够减少该模型肝癌肝内转移率,减轻病情;能够降低肝脾肿大增生;以中高浓度(0.5g生药/kg体重和/或1.0g生药/kg体重)为佳。
4、不同浓度莪莲柴胡汤均能够上调荷瘤鼠肝组织、癌旁组织和癌组织PTEN蛋白的表达,尤其以中浓度(0.5g生药/kg体重)为佳。