研究背景肌腱为连接着肌肉和骨的结缔组织,其将肌肉收缩产生的力传导至骨,产生运动并维持着静息状态时姿势。肌腱因为经常承受着牵伸负荷容易导致肌腱纤维微损伤,最终导致肌腱病。老龄化已经被证实为肌腱病的一个重要影响因素,另外老龄化还导致肌腱损伤后修复困难以及修复后不能达到正常的力学性质和功能状态。当前针对老龄化导致的肌腱病治疗选择相当有限并且往往临床效果不佳,主要原因是对老龄化导致的肌腱病的认识仍有待深入。既往研究已经揭示了一些老龄化肌腱的结构改变以及发病的分子机制,然而老龄化肌腱中肌腱干细胞如何变化,以及适度机械牵伸对老龄化肌腱损伤的愈合究竟起何作用仍没有定论。本研究的目的是尝试通过明确老龄化肌腱干细胞的特性,研究适度体外牵伸和适度跑台训练对老龄化肌腱干细胞的影响,探讨适度适度跑台训练对老龄化肌腱损伤愈合的作用,最终能够为老龄化肌腱病的临床治疗提供一些线索和启示。材料与方法24只20月龄Fisher雌性老龄大鼠和6只2月龄Fisher雌性成年大鼠被应用于本课题研究。首先老龄大鼠和成年大鼠各6只用以比较老龄和成年大鼠髌腱来源肌腱干细胞干性、增殖能力和分化特征的差异;然后我们比较观察了老龄大鼠髌腱来源肌腱干细胞在4%适度牵伸后肌腱干细胞发生的变化;接着18只老龄大鼠被随机分配至适度跑台训练组和笼中自由活动组,每组各9只。第1周老龄大鼠跑台训练方案为:13米/分钟,15分钟/天,5天/周;第2-4周老龄大鼠跑台训练方案为:13米/分钟,30分钟/天,15分钟/天,5天/周。老龄大鼠跑台训练结束后,每组各3只老龄大鼠处死用以获得肌腱干细胞并首先用以比较肌腱干细胞各种特性。每组剩下6只老龄大鼠被用以制作髌腱缺损模型,并分别在模型制作结束后第4周和第8周处死老龄大鼠用以评价肌腱缺损愈合情况。结果1.老龄化肌腱干细胞的特征。我们首先对老龄化肌腱干细胞进行了干细胞表面标记流式分析和核内标记的免疫荧光染色鉴定。结果显示:老龄化髌腱来源肌腱干细胞表面标记物cd90、stro-1和ssea-1表达阳性;而cd34、cd45、cd44、cd31表达阴性。老龄化髌腱来源肌腱干细胞核内干细胞标记物oct-4、ns和nanog表达阳性。2.老龄化弱化了大鼠髌腱来源肌腱干细胞的增殖和自我更新能力。孵箱孵育10-16天后,倒置光显微镜下分别可见老龄大鼠和成年大鼠肌腱干细胞克隆。老龄大鼠髌腱克隆来源的肌腱干细胞p0形态不均一,肌腱干细胞向心性较弱,细胞核浑浊不明显;而成年大鼠髌腱来源的肌腱干细胞p0形态均一,多呈四边形;细胞呈中央向心性排列。与成年大鼠髌腱来源的肌腱干细胞p0相比,老龄大鼠老龄大鼠髌腱来源的肌腱干细胞p0细胞形态更加细长,多变而不均一,细胞核大而不明显,排列更加紊乱。老龄大鼠和成年大鼠髌腱来源肌腱干细胞皆表达cd90,统计结果显示成年大鼠髌腱来源肌腱干细胞cd90表达阳性率要高于老龄大鼠髌腱来源肌腱干细胞,两者有显著性差异。老龄大鼠和成年大鼠髌腱来源肌腱干细胞oct-4,nanog,ns免疫染色均阳性。老龄大鼠髌腱来源肌腱干细胞的pdt为34.9±1.4h;而成年大鼠髌腱来源肌腱干细胞的pdt为23.9±0.8h,两者具有显著性差异(p<0.01)。老龄大鼠和成年大鼠髌腱来源的肌腱干细胞孵育24小时的平均od分别为:0.62±0.04;0.47±0.05;两者具有显著性差异(p=0.002);老龄大鼠和成年大鼠髌腱来源的肌腱干细胞孵育48小时的平均od分别为:0.73±0.03,0.54±0.03,两者具有显著性差异(p=0.004)。老龄大鼠髌腱来源肌腱干细胞p1coli,lpl,colii和osteocalcin表达分别为成年大鼠髌腱来源肌腱干细胞p1表达的0.4,2.1,1.5和5.6倍。3.体外适度牵伸和适度跑台训练增强老龄肌腱干细胞的克隆和增殖能力,并诱导老龄肌腱干细胞向肌腱细胞分化。老龄大鼠髌腱来源的肌腱干细胞在4%机械牵伸后,其核内干细胞表达标记oct-4,nanog和ns表达增加;肌腱干细胞的增殖也显著增加。老龄大鼠髌腱来源肌腱干细胞p1在4%机械牵伸24小时后,rt-pcr结果显示:coii,colii,lpl和osteocalcin表达分别为未牵伸组的4.14倍,0.27倍,0.23倍,0.70倍。适度跑台训练组和笼中自由活动组老龄大鼠髌腱来源肌腱干细胞都能形成克隆,然而跑台组老龄大鼠髌腱来源肌腱干细胞形成的克隆数目更多,直径更大;而且肌腱干细胞的形态变得均一。适度跑台训练组老龄大鼠tscs的增殖能力增加了31%(p<0.01);od值增加了10%(p=0.04)。流式分析结果显示:适度跑台训练组老龄大鼠肌腱干细胞ssea-1和stro-1阳性率分别为对照组的2.46倍和6.25倍。另外qrt-pcr结果显示:适度跑台训练组老龄大鼠oct-4和nanog的表达分别为笼中自由活动组的4.17倍和3.23倍;而适度跑台训练组组老龄大鼠肌腱干细胞Col I,Sox-9,PPAR和Runx-2分别为对照组3.50倍,0.01倍,0.27倍和0.13倍,具有显著性差异。4.适度跑台训练增强了老龄大鼠肌腱愈合能力。我们成功制备了跑台训练组和笼中自由活动组老龄大鼠髌腱缺损模型。老龄大鼠髌腱缺损模型制作4周后,取髌腱组织并行HE染色,结果显示:跑台训练组和笼中自由活动组两组老龄大鼠髌腱缺损模型都未完全愈合,而笼中自由活动组髌腱缺损较之跑台训练组明显。老龄大鼠髌腱缺损模型制作8周后,大体观跑台训练组老龄大鼠的髌腱缺损已消失,而笼中自由活动组仍较明显;髌腱组织HE染色结果显示:跑台训练组髌腱缺损已被较多增殖肌腱细胞填充,且肌腱纤维排列较整齐;而笼中自由活动组原髌腱仍可见空白区以及排列紊乱的肌腱纤维。免疫组化结果证实跑台训练组老龄大鼠的髌腱缺损区有较多新生的胶原组织。结论老龄化髌腱来源肌腱干细胞的干性降低,并且其增殖能力,克隆能力都显著下降;老龄化肌腱干细胞更易于向非肌腱细胞分化。体外适度牵伸和适度跑台训练增强了老龄化肌腱干细胞的增殖能力,并促进老龄化肌腱干细胞向肌腱细胞分化,说明其可以有效对抗老龄化对肌腱干细胞的不利影响;适度跑台训练还促进了体内肌腱缺损的修复。本课题研究展示了老龄化肌腱干细胞的特征,揭示了适度机械牵伸对老龄化髌腱来源肌腱干细胞的作用以及适度跑台训练对老龄化髌腱缺损修复的作用,为以后的组织工程研究和临床治疗肌腱病提供了有益的参考。