第一部分ITP中MBD2和MBD4表达与DNA甲基化水平相关性研究研究背景及目的:DNA甲基化与疾病的关系已逐渐成为生物医学研究的新热点之一。近年来的研究显示许多自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus,SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)等都检测到基因组DNA的低甲基化,且这种低甲基化在疾病的发病机制中发挥着重要的作用。特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一种以血小板破坏加速为主的器官特异性自身免疫性疾病,具体发病机制未完全清楚。为了明确DNA甲基化异常在ITP发病中的作用机制,我们对ITP中两种甲基化CpG结合域蛋白(methyl CpG-binding domain,MBD)与DNA的甲基化进行了相关性研究。方法:运用甲基化芯片筛选ITP中甲基化异常变化的基因;ELISA检测16例ITP患者和10例正常对照的CD4+T细胞脱氧甲基胞嘧啶(deoxymethylcytosine,dmC)的浓度。用SYBR Green实时定量PCR方法测定45例ITP患者与20例正常对照外周血单个核细胞及10例ITP患者及9例正常对照的CD4~+及CD4~-细胞MBD2和MBD4mRNA的相对表达水平,探讨DNA甲基化水平与MBD2和MBD4两种酶之间的相关性,并分析其与临床参数之间是否存在相关性。结果:ITP患者的CD4~+和CD4~-细胞的甲基化水平(0.6640,0.4432-0.9691),(0.4562,0.0900-0.9096、)均低于正常对照(0.9012,0.8019-1.1148),(0.8252,0.4579-1.0169),并具有显著的统计学意义差异(P值分别为0.0001,0.0029);ITP患者外周血单个核细胞中MBD2和MBD4的mRNA表达均低于对照组,且亦有统计学差异(P＜0.0001)。在ITP患者的CD4~+和CD4~-细胞中均发现两种酶的低表达.有趣的是在正常对照中两种酶的mRNA表达与DNA甲基化水平呈正相关(MBD2与MBD4的r~2分别为0.7181,0.6084,P值分别为0.0039,0.015),在ITP患者中两种酶的mRNA表达水平却与DNA的甲基化水平呈负相关(其r~2分别为0.6038,0.4975,P值分别为0.0082,0.027)。结论:在ITP患者的CD4~+和CD4~-细胞中均存在DNA的低甲基化,提示DNA低甲基化在ITP发病中起一定的作用。而ITP中存在两种酶的低表达且与DNA甲基化水平呈负相关,提示这两种酶在ITP的发病中发挥重要的作用且对其低甲基化有一定的促进作用,但其具体机制还有待于进一步研究。第二部分5氮杂胞苷对ITP患者IFN-γ和IL-4表达的影响研究背景及目的:目前公认CpG甲基化对基因转录起负调控的作用,但它与细胞因子表达的相关性至今尚不清楚。IFN-γ和IL-4是两个影响na(i|¨)ve T细胞向Th1和Th2细胞分化的关键性细胞因子。5氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azaC)是一种常用的甲基化抑制剂.本研究对5-azaC对IFN-γ和IL-4的影响进行了相关研究以明确低甲基化在ITP发病机制中的作用。方法:应用5-azaC处理ITP患者和正常对照的外周血单个核细胞(PBMC)和脾细胞(SP),实时定量(RQ-PCR)检测IFN-γ和IL-4 mRNA的表达,ELISA检测培养细胞上清中IFN-γ和IL-4的含量,流式细胞术(FCM)检测CD4~+T(Th)细胞和CD8~+T(Tc)细胞胞浆内细胞因子IFN-γ和IL-4的表达水平。结果:RQ-PCR结果表明,与未处理组相比,5-azaC处理后的ITP患者PBMC的IFN-γ的mRNA表达明显升高(P=0.0161),而脾细胞的IFN-γmRNA和IL-4 mRNA表达水平则没有明显差异;ELISA检测结果发现,与未处理组相比,经5-azaC处理后的正常对照组和ITP患者外周血细胞培养上清中IFN-γ的含量均有降低的趋势但未达到统计学意义(P值分别为0.068,0.076),但在正常对照组降低程度更明显(0.4717±0.2696 vs.0.7799±0.2624)(P=0.011):ITP患者脾脏5-azaC处理后上清中IFN-γ的含量则没有明显差异(P=0.335):FCM检测结果表明,相对于未处理组,5-azaC处理后的ITP患者IFN-γ和IL-4均无明显变化,而正常对照组IFN-γ表达减低(P＜0.05),IL-4的变化则不明显(P＞0.05)。此外,经5-azaC处理后正常对照组和ITP患者组的T1/T2均无明显变化。结论:5-azaC能够促进ITP患者和正常对照组PBMC的IFN-γmRNA表达,但抑制相应的IFN-γ蛋白的分泌,且对正常对照的抑制作用更明显;5-azaC对T细胞极化的影响不明显。此外,5-azaC对ITP患者脾细胞IFN-γmRNA和蛋白分泌影响不明显。第三部分DNMT3B基因启动子单核苷酸多态性C46359T与中国北方汉族人群ITP发病的相关性研究研究背景及目的:特表观遗传学尤其是DNA甲基化的改变与免疫细胞的分化及功能表达联系密切,在自身免疫反应中发挥重要的作用。已知基因启动子区的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)能够影响基因的表达或酶的活性,而DNA甲基化是由DNA甲基化转移酶家族(包括DNMT1、DNMT2及DNMT3A、DNMT3B和DNM73L)催化介导的,因此,DNMT3B基因启动子区—149位单核苷酸多态性(C463597)与多种疾病等危险性的相关性已得到关注。本实验旨在探讨DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性与特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)发病的相关性。方法:采用PCR—RFLP结合DNA测序技术检测201例ITP患者及136例正常对照DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性。结果:在ITP患者和正常对照中均未检测到C/C基因型。在正常对照中T/T纯合型和C/T杂合型及T、C等位基因的频率分别为97.8%、2.2%、98.9%和1.1%。ITP患者和正常对照之间的基因型和等位基因频率相比无统计学差异(P值分别为0.745和0.747)。ITP患者按年龄和病程分组,儿童组和成人组、儿童急性组和慢性组及成人急性组和慢性组之间的基因型和等位基因的分布均无统计学差异。结论:ITP患者和正常对照的DNMT3B基因启动—149位基因型的基因型分布类似;中国北方人群中,DNMT3B基因启动子—149位基因多态性不能作为ITP易感性的一个预测指标。第四部分Bmi-1在特发性血小板减少性紫癜中的表达研究背景及目的:Th2细胞减少导致的Th1/Th2倾向于Th1极化参与特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)的发病。B细胞特异单克隆鼠白血病病毒整合位点基因(B cell-specific MLV integration site-1,Bmi-1)属Polycomb(PcG)基因家族成员,它是维持造血干细胞自我更新关键的转录因子。最近的研究提出Bmi-1可通指环依赖的方式调控GATA-3的稳定性,进而调控Th2的分化。为了探讨Bmi-1在ITP的发病是否发挥作用,我们检测了Bmi-1在ITP患者外周血单个核细胞和脾细胞中的表达。方法:采用实时定量PCR的方法检测了45例ITP患者和23例正常对照外周血单个核细胞,及10例ITP CD4~+和9例ITP CD4~-细胞中Bmi-1的mRNA表达水平,并分析其与各种临床参数之间的相关性.同时,用Western blot检测了Bmi-1在4例正常对照和5例TIP患者外周血单个核细胞中的蛋白表达水平,还用免疫组化检测了Bmi-1在脾脏中的表达分布情况。结果:在ITP的外周血单个核细胞中Bmi-1的mRNA表达水平低于正常对照(P＜0.0001):在ITP的CD4~+细胞中也存在Bmi-1的低表达,与正常对照相比有统计学差异(P=0.0133).但在CD4~-细胞,ITP中Bmi-1的mRNA表达与正常对照相比没有统计学差异。检测的5例ITP患者外周血单个核细胞中的Bmi-1的蛋白表达均低于正常对照.在脾脏中Bmi-1广泛细胞核阳性表达,但仍可见ITP患者脾细胞的阳性表达弱于正常对照。结论:ITP患者中存在Bmi-1的低表达,且在CD4~+细胞中具有Bmi-1的低表达,而在CD4~-其表达与正常对照无差异。Bmi-1可能在ITP中发挥作用,主要是通过对Th细胞起作用。