论文部分内容阅读
研究目的和背景:同种异体心脏移植已经成为治疗终末期心脏疾病的重要手段,但移植术后最常发生的急性排斥反应(acute rejection)仍然显著地制约着心脏移植的治疗效果。目前临床上对急性排斥反应的治疗方法主要是用免疫抑制剂(如环孢素A)和大剂量糖皮质激素(如甲基氢化泼尼松)冲击治疗,这种方法具有严重的毒副作用。如终身服用免疫抑制剂药物可造成机体肝肾功能受损、免疫功能低下、继发感染和肿瘤等疾病;并且目前这些主要针对T细胞免疫的治疗方法并不能完全抑制急性排斥反应,更不能诱导免疫耐受。因此,研发抑制急性排斥反应的新药物具有重要的意义。CVF(cobra venom factor,蛇毒因子)被认为是一种具有临床应用潜力的新型免疫抑制剂,其通过消耗补体抑制异种器官移植超急排斥反应(super acute rejection)的作用已经得到肯定;但是,对于CVF能否抑制以T细胞激活为主的急性排斥反应仍然不确定。我们课题组先期的实验研究发现,CVF可以使Wistar -SD大鼠同种异体供心术后平均存活时间从6.60±0.65天延长至13.44±2.08天。由于Wistar大鼠及SD大鼠均为封闭群大鼠,为了排除基因背景不纯产生的影响,我们将CVF运用于近交系BN-LEWIS大鼠同种异体心脏移植模型。结果同前类似,CVF使供心术后平均存活时间从6.65±0.34天延长至11.69±0.71天,移稙心脏排斥反应程度和T细胞浸润数量也明显下降。上述两次实验结果均表明CVF可以有效地抑制大鼠同种异体心脏移植的急性排斥反应,减少T细胞浸润,延长术后供心的存活时间。为了更深入地了解CVF上述作用的机理,我们拟建立BALB/c-C57近交系小鼠同种异体心脏移植模型。此模型动物品系纯合度高,可以方便运用源于小鼠的分子生物学试剂及单克隆抗体进行检测。在此模型基础上,我们验证CVF能否在体内抑制以T细胞激活为主的急性排斥反应,并初步探讨其机制。希望能为CVF作为一种新型免疫抑制药物早日应用于临床提供帮助。方法1.采用Heron袖套管(Cuff)技术将供体BALB/c小鼠的心脏移植至受体C57小鼠颈部,建立BALB/c-C57近交系小鼠同种异体颈部异位心脏移植动物模型。术后用心电图及心脏彩超检查供心存状况。正式实验拟建立了64例模型,随机分成对照组和实验组各32例。实验组受体C57小鼠在术前24小时经眶静脉窦注射CVF 50μg/kg和术后每三天经眶静脉窦注射CVF 20μg/kg下直至移植心停跳;对照组受体C57小鼠经同样方法注射等容量的生理盐水作为空白对照。2.对照组和实验组各随机抽出12例,分别于术后3天、5天、7天活杀4例取出供心行HE染色判定供心排斥反应的病理分级、免疫组化分析MHC-Ⅱ抗原、B7-1和B7-2共刺激分子的表达水平。剩余的对照组及实验组各20例观察其供心术后存活时间,并从每组中随机抽出8例分别在心脏移植术结束时,和术后1小时、6小时、12小时、2天、4天、6天、8天分别经眶静脉窦抽血,用50%溶血法(CH50)测补体活性。3.利用全自动图像分析系统(Image-Pro? Plus version 6.0),将病理检查结果转化为数据并运用SPSS 13.0软件进行分析,并初步探讨可能的作用机制。结果1.成功地建立了成功率高且可靠稳定的BALB/c-C57近交系小鼠同种异体颈部异位心脏移植模型。手术时间为60～70分钟,供心热缺血2～5分钟,冷缺血20～25分钟,手术成功率为96%。2.对照组与实验组的血清补体活性(%)有非常显著的差异(p<0.01)。对照组补体活性始终无明显变化,始终维持在高水平(85%~100%);实验组(CVF注射处理)在移植术后1小时血清补体活性下降了一半左右,术后6小时降至10%以下,术后2天几乎为0,术后4天维持在20%以下,术后6天维持在50%以下,术后8天几乎恢复正常水平。3.生存分析结果显示对照组供心术后平均生存时间为7.91±0.35天,而实验组供心术后平均生存时间为24.03±1.39天,是对照组的3倍,两者比较有非常显著差异(p<0.01)。4. HE染色结果显示对照组术后3天均发生Ⅱ级以上的急性排斥反应,术后5天均发生Ⅲ级以上的急性排斥反应,术后7天均发生Ⅳ级急性排斥反应;而实验组术后3天、5天均未发生急性排斥反应,仅有2例于术后7天发生Ⅰ级急性排斥反应。免疫组化结果显示MHC-Ⅱ抗原、B7-1和B7-2共刺激分子主要由抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APC)表达,心肌纤维细胞本身不表达,但供心血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)可在发生急性排斥反应过程被诱导表达自身MHC-Ⅱ抗原。实验组上述抗原和共刺激分子的总体表达水平以及单个细胞表达水平均明显低于对照组,两组比较有非常显著差异(p<0.01)。上述抗原和共刺激分子的总体表达水平与急性排斥反应程度呈密切正相关。结论1.我们建立的BALB/c-C57近交系小鼠同种异体颈部异位心脏移植模型是心脏移植免疫学研究的理想动物模型;2. CVF可以有效地抑制心脏移植发生的急性排斥反应,延长移植心术后平均存活时间(p<0.01)。3. CVF可以显著减少移植心VEC和APC表达MHC-Ⅱ抗原(p<0.01),以及显著减少APC表达B7-1和B7-2共刺激分子(p<0.01),其机制有待进一步研究。