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本试验采用番泻叶复制动物脾虚模型,并给予加味四君子汤治疗,旨在揭示脾虚证的发病机理以及加味四君子汤的作用机制,为加味四君子汤治疗脾虚证提供参考依据。采用随机分组设计,将24只1岁龄健康比格犬随机均分为对照组、脾虚组、自然恢复组和加味四君子汤组,每组6只。用番泻叶药液复制犬脾虚模型。第7天造模成功,脾虚组犬处死采样,对照组和自然恢复组犬饲喂基础日粮,加味四君子汤组犬在基础日粮中添加2%加味四君子汤。试验期14天。第0、7、14天,采集血液,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6水平;在第14天,全部试验犬处死采样,采集脾脏计算脾脏指数,测定脾脏组织中促吞噬肽(Tuftsin)水平,观察脾脏显微和超微结构的变化;采集十二指肠、空肠和回肠,应用免疫组织化学(IHC)检测小肠各段分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白阳性表达水平;荧光定量PCR检测小肠各段免疫球蛋白A(IgA)、IgG、IgM以及紧密连接蛋白ZO-1、OccludinmRNA的相对表达量;蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测小肠各段ERK/MAPK通路中相关蛋白Ras、MEK1、ERK1/2以及p-ERK1/2的表达水平。结果显示:1.在第7天,与对照组犬相比,脾虚组、自然恢复组和加味四君子汤组犬血清IL-4、IL-6水平显著升高(P<0.05),IFN-y、IL-2水平显著降低(P<0.05);在第14天,自然恢复组犬血清IL-4、IL-6水平略有下降,IFN-y、IL-2水平略有升高,各指标较对照组差异显著(P<0.05);加味四君子汤组犬血清IL-4、IL-6水平明显下降,IFN-y、IL-2水平明显升高,各指标较对照组犬差异不显著(P>0.05)。2.与对照组犬相比,脾虚组犬脾脏指数、脾脏Tuftsin水平极显著降低(P<0.01);自然恢复组犬脾脏指数、脾脏Tuftsin水平显著降低(P<0.05);加味四君子汤组犬脾脏指数、脾脏Tuftsin水平差异不显著(P>0.05)。3.光镜下观察,对照组犬脾脏组织结构完整,红髓白髓边界清晰可辨;脾虚组犬脾窦充血,白髓淋巴细胞减少,脾小体萎缩;加味四君子汤组犬脾脏组织结构与对照组相比无明显差异。电镜下观察,对照组犬脾脏淋巴细胞结构基本正常,细胞间连接紧密,细胞器较完整;脾虚组犬明显可见脾脏淋巴细胞核膜间隙增宽,核固缩,线粒体空泡样病变;加味四君子汤组犬脾脏淋巴细胞与对照组相比无明显差异,但仍可见部分细胞存在修复痕迹。4.与对照组犬相比,脾虚组和自然恢复组犬十二指肠sIgA、ZO-1、Occludin蛋白阳性表达水平极显著降低(P<0.01),其中自然恢复组犬高于脾虚组;加味四君子汤组犬上述指标较对照组差异不显著(P>0.05)。试验犬空肠和回肠中上述指标变化趋势与十二指肠一致。5.与对照组犬相比,脾虚组和自然恢复组犬十二指肠IgA、IgG、IgM、ZO-1以及OccludinmRNA相对表达量显著或极显著降低(P<0.05,P<0.01),其中自然恢复组犬高于脾虚组;加味四君子汤组犬上述指标较对照组差异不显著(P>0.05)。试验犬空肠和回肠中上述指标变化趋势与十二指肠一致。6.与对照组犬相比,脾虚组和自然恢复组犬十二指肠中Ras、MEK1、ERK1/2以及p-ERK1/2的表达水平极显著降低(P<0.01),其中自然恢复组犬高于脾虚组;加味四君子汤组犬上述指标较对照组差异不显著(P>0.05)。试验犬空肠和回肠中上述指标变化趋势与十二指肠一致。试验证实,脾虚犬血清细胞因子水平紊乱,脾脏组织结构受损,且肠道免疫球蛋白以及紧密连接蛋白的低表达可能与ERK/MAPK通路被抑制有关。加味四君子汤可以调节细胞因子水平,修复受损脏器,激活ERK/MAPK通路,提高肠道黏膜免疫,有效改善脾虚犬免疫机能低下的状态。