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不定根发生既是林木无性系选育与推广的关键,又涉及植物发育生物学领域最为基本的科学理论,关于林木不定根发生的分子调控机制迄今尚待深入研究与阐释。不同于mRNA和miRNA已经研究的较为深入,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)虽然已被证实广泛参与植物生长发育和逆境胁迫响应,但仍然缺乏深入、系统的研究。尽管林木lncRNA也被大量预测,但其真实性的鉴定及生物学功能鲜有报道。本研究以模式树种杨树的不定根为研究对象,通过高通量转录组测序挖掘和鉴定了一批与不定根发生发育相关的lncRNA,并进一步系统地对lnc12和lncWOX11进行了克隆鉴定及生物学功能验证。主要研究结论如下:(1)通过对杨树不定根发生相关的组织进行链特异性cDNA文库构建与深度测序,获得了5952个lncRNAs和45,778个蛋白编码基因。与蛋白编码基因相比,多数lncRNAs的长度更短,外显子个数更少,表达量明显较低,同时在不同物种中的保守性也较差。在杨树不定根发生过程中有933 lncRNAs(DELs)和1,8451个蛋白编码基因(DEGs)显著差异表达。基于生物信息学深度分析揭示,许多参与不定根发生的经典信号通路(如生长素信号转导途径)及重要转录因子(如WOX11)都可能受到lncRNA的调控作用。(2)利用RACE技术克隆得到了1个参与生长素信号转导途径的长链非编码RNA——lnc12。lnc12的cDNA全长为1372 bp,具有典型的5’端帽子结构和3’端多聚腺苷酸尾巴,预测其有1个长159 bp的小开放阅读框(sORF)。通过构建35S::lnc12 sORF–GFP和35S::lnc12 5’UTR+sORF–GFP载体,并在杨树原生质体中进行瞬时表达验证,发现lnc12不具有编码能力。经过lnc12的过表达载体构建、杨树稳定遗传转化及阳性植株筛选,获得lnc12过表达转基因杨树。lnc12过表达转基因杨树微扦插生根时间明显延迟,生根率显著降低,不定根及其根毛数目也少于对照植株。在培养基中添加NAA后能够很大程度恢复这些生根缺陷,推测lnc12可能通过调控生长素信号转导途径中的相关基因的表达抑制杨树不定根和根毛的形成与发育。(3)本实验室之前的研究表明,PeWOX11在杨树不定根发生过程中起着至关重要的作用,其过表达转基因杨树的不定根显著增加,茎和叶上也产生了大量异位根。本研究通过克隆得到了1个可能调控PeWOX11的lncRNA——lncWOX11。lncWOX11的cDNA长度为215 bp,包含一个51 bp的小ORF框。生物信息分析和瞬时表达检测均揭示lncWOX11没有编码能力。lncWOX11在杨树不同组织中具有动态的表达模式,在1周龄的不定根中具有较高的表达丰度。LncWOX11过表达转基因杨树的不定根数目显著减少,这说明lncWOX11抑制了杨树不定根的形成和发育。(4)通过预测发现lnc12可能通过顺式作用调控20个蛋白编码基因,同时也可能通过反式作用调控12个蛋白编码基因。而lncWOX11可能通过顺式作用8个蛋白编码基因。为了探究这2个lncRNA与其靶基因的调控关系,不仅检测了这些靶基因在lnc12和lncWOX11过表达转基因杨树中的表达量,同时还构建了lnc12和lncWOX11的多靶点CRISPR/Cas9敲除载体,并进行了杨树原生质体瞬时表达。基于上述功能获得型和敲除缺失型互补验证,揭示了lnc12正调控PeSCE1并负调控PeSAUR72的表达,而lncWOX11负调控PeWOX11的表达。(5)前已述及,lncWOX11过表达转基因杨树与PeWOX11过表达转基因杨树的表型是互补的,这证实了lncWOX11对功能基因PeWOX11的负向调控模式。然而PeSCE1和PeSAUR72在杨树中的生物学功能未知,lnc12与这2个靶基因在杨树发育过程中产生的表型性状是否一致或互补是无法判断的。因此我们对这2个基因进行了克隆和功能研究。结果表明,PeSCE1过表达杨树的不定根数目和根毛数目都显著减少,而PeSAUR72过表达杨树的不定根数目和根毛都明显增加。这些结果进一步揭示了lnc12对PeSCE1和PeSAUR72的调控作用。综上所述,lnc12和lncWOX11通过调控功能基因的表达从而介导杨树不定根的发生与发育。