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炭疽病(anthrax)是由炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)引起的急性人兽共患传染病,人群普遍易感。由于其高度致病性、其芽胞在恶劣环境中有较强的生存能力以及可通过气溶胶途径感染等特点,长期以来被认为是首选的生物战剂,并用于生物恐怖袭击。炭疽病在发病的早期,没有明显的特异性症状,诊断较为困难。目前治疗的主要手段为对症处理和尽早地使用大剂量青霉素用于杀灭体内的细菌,但青霉素对炭疽杆菌产生的外毒素并无作用。炭疽外毒素是致病的主要因素,治疗炭疽的关键是抑制炭疽外毒素的作用。炭疽外毒素由三种蛋白组成：保护性抗原(protective antigen, PA)、致死因子(lethal factor, LF)和水肿因子(edema factor, EF)。LF与PA结合,构成致死毒素(lethal toxin, LeTx);EF与PA结合,构成水肿毒素(edema toxin, EdTx)。PA是炭疽杆菌最主要的免疫原,能诱导机体产生保护性免疫。目前炭疽外毒素的致病作用机制已经认识得比较清楚,PA在炭疽致病作用中起核心作用,从而使得它成为一个很好的诊断和治疗靶点。本课题利用DNA重组技术制备具有天然活性的可溶性PA63,利用杂交瘤技术制备特异性抗PA15单克隆抗体,并建立了抗原捕获ELISA检测方法,有望用于炭疽临床样本的免疫学诊断。研究目的：1.表达pCold Ⅱ-PA63和pCold Ⅱ-PA15重组质粒,纯化可溶性PA63和PAl5蛋白,并对重组蛋白进行鉴定。2.用可溶性的PA63免疫小鼠,利用杂交瘤技术,制备、筛选、鉴定抗PA15单克隆抗体。3.初步建立抗原捕获ELISA检测方法,以此来检测感染炭疽患者血清中的保护性抗原,用于炭疽病的早期诊断。研究方法：1.将合成的PA63基因和PA1s基因分别插入pCold Ⅱ表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,采用His亲和层析柱纯化,获得可溶性PA63和PAls蛋白。2.可溶性PA63作为抗原免疫BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾细胞与SP2/0细胞融合,用PA1s蛋白包板,筛选抗PA1s单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备腹水,经Protein G亲和层析柱纯化单克隆抗体,纯化的抗体应用SDS-PAGE、Western Blot、免疫沉淀、质谱分析、ELISA等方法,鉴定抗PA1s单克隆抗体的生物学特性。3.建立抗原捕获ELISA方法,检测炭疽感染者血清中的保护性抗原。研究结果：1.成功表达了pCold Ⅱ-PA63和pCold Ⅱ-PA15重组质粒,并纯化了可溶性His融合PA63蛋白和PA1s蛋白。2.利用杂交瘤技术,获得了稳定、持续分泌抗PA1s单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D7和8E9,抗体效价分别为1：12800和1：6400,可与天然构象的PA蛋白发生特异性结合。3.选用与保护性抗原有较高亲和力的单抗3D7建立了抗原捕获ELISA检测方法,可定量检测PA63,其检测阈值为16ng/ml。应用该方法检测2例炭疽感染者的血清,血清中的保护性抗原分别约为125ng/ml和63ng/ml。结论：本研究成功制备了两株抗炭疽PA1s单克隆抗体,初步建立了抗原捕获ELISA方法,用于检测感染炭疽杆菌患者血清中的保护性抗原,为进一步研制炭疽病免疫学检测试剂盒奠定了基础。